山豆根黃酮類成分對(duì)斑馬魚的急性毒性研究

袁文琳，黃崢蕊，肖思佳，張衛(wèi)東*，沈云亨*

1.海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）藥學(xué)院，上海 200433

2.西安理工大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)系，陜西 西安 710048

山豆根又名廣豆根、越南槐根，是豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，臨床用于治療火毒蘊(yùn)結(jié)、乳蛾喉痹、咽喉腫痛、齒齦腫痛、口舌生瘡等癥狀[1-2]。山豆根入藥的中藥制劑如桂林西瓜霜、清咽潤(rùn)喉丸、清膈丸等均收錄于《中國藥典》，山豆根對(duì)肝炎、哮喘、慢性支氣管炎和咽喉腫痛具有較好的治療效果[1-4]。然而山豆根臨床不良反應(yīng)報(bào)道時(shí)有發(fā)生[5-7]，《中國藥典》1985年版首次記載山豆根有毒，山豆根毒性反應(yīng)涉及體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)-器官，可引起肝臟損傷、神經(jīng)毒性、心血管系統(tǒng)損害、胃腸道反應(yīng)、皮膚過敏反應(yīng)等[7-10]。山豆根含有生物堿類、黃酮類、三萜類、多糖、有機(jī)酸等多種化學(xué)成分，以生物堿和黃酮類成分為主，代表性成分包括苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因、山豆根酮等[11-15]。對(duì)于山豆根毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，多集中于《中國藥典》含量測(cè)定限定的苦參堿和氧化苦參堿[16]，及其他含量較高的生物堿類成分[17-18]，對(duì)黃酮類等非生物堿類成分毒性研究較少。上海中醫(yī)藥大學(xué)安全評(píng)價(jià)中心研究發(fā)現(xiàn)，不同活性組分可能具有不同毒性，山豆根乙醇提取物對(duì)斑馬魚模型具有肝毒性，正丁醇、二氯甲烷部位有心血管毒性和肝毒性，且對(duì)小鼠的毒性研究中觀察到肝毒性[19]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，山豆根70%乙醇提取物中含有大量黃酮類成分，能夠?qū)D大鼠產(chǎn)生明顯肝臟損傷。山豆根毒性成分不僅包括生物堿類，黃酮類成分也可能是毒性成分之一，目前對(duì)于山豆根黃酮類單體成分的毒性報(bào)道極少，進(jìn)一步探究山豆根毒性成分對(duì)其安全合理用藥尤為重要。

本研究通過人心肌細(xì)胞AC16、人正常肝細(xì)胞L-02、人腎小管上皮細(xì)胞HK-2和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y毒性實(shí)驗(yàn)，對(duì)山豆根提取物、組分及主要單體成分逐步進(jìn)行篩選，確定山豆根提取物主要的細(xì)胞毒組分，鑒定細(xì)胞毒組分中主要的化學(xué)成分，評(píng)價(jià)細(xì)胞毒組分中主要成分的細(xì)胞毒性；再進(jìn)一步利用斑馬魚急性毒性模型，對(duì)鑒定的細(xì)胞毒成分進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞購自美國ATCC。

1.2 動(dòng)物

野生AB品系斑馬魚購自杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（浙）2012-0171。斑馬魚用（28±0.5）℃養(yǎng)魚用水（每升反滲透水含200 mg速溶海鹽、50～100 mg/L CaCO3、pH 6.5～8.5、電導(dǎo)率450～550 μs/cm），于（28±2）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用受精后2 d（2 dpf）的斑馬魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)001458）。

1.3 藥材

山豆根（批號(hào)20190305，產(chǎn)地為廣西靖西縣）購自廣西宏锃藥業(yè)有限公司，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院沈云亨副教授鑒定為豆科植物越南槐S.tonkinensisGagnep.的干燥根，山豆根中苦參堿和氧化苦參堿總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.82%，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定[1]。藥材標(biāo)本（20190305-SDG）保存于海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室。

1.4 藥品與試劑

對(duì)照品苦參堿（批號(hào)drk-0448-930730）、氧化苦參堿（批號(hào)drk-0453-930327）、馬卡因（批號(hào)drk-0341-940422）購自成都德銳可生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%；山豆根酮對(duì)照品（批號(hào)S0304AS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）購自大連美倫生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)USP6F1S）購自德國WAK-Chemie Medical GmbH公司；甲基纖維素（批號(hào)079K0054V）美國Sigma公司；分析純無水乙醇、甲醇購自上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)C11995500CP）、PBS緩沖液（批號(hào)10010-023）、RPMI 1640（批號(hào)C11995500BT）購自美國Gibco公司；胎牛血清（批號(hào)10099-141）購自美國Hyclone公司；牛血清白蛋白（批號(hào)wxbc6759v）、0.05%胰酶-EDTA（批號(hào)25300-054）購自美國Life Technologies公司；Cell Titer Glo試劑（批號(hào)0000350448）購自美國Promega公司；4%多聚甲醛購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；二甲苯購自上海麥克林生化科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色液購自上海依赫生物科技有限公司。

1.5 儀器

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)皿、75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國Coning公司）；6孔板（無錫耐思生命科技股份有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；LDZX型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；多功能檢測(cè)儀（美國Bio Tek公司）；HFsafe-1200LC型生物安全柜（上海力新儀器有限公司）；Boxun超凈工作臺(tái)、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SZX7型解剖顯微鏡（日本Olympus公司）；CCD相機(jī)（上海土森視覺科技有限公司）；CP214型精密電子天平（中國OHAUS公司）。

2 方法

2.1 山豆根提取物的制備

2.1.1 山豆根水提物（SDG-SJ）的制備 取1 kg干燥粉碎的山豆根藥材，加入6倍量水，浸泡30 min，加熱煮沸后，煎煮1 h，濾過；藥渣加入6倍量水，重復(fù)煎煮1次，濾過，合并2次濾液，真空減壓濃縮得到0.47 kg浸膏，于低溫真空干燥箱干燥得到0.16 kg干浸膏，粉碎后得到0.15 kg SDG-SJ。

2.1.2 山豆根醇提物（SDG-Et）的制備 取1 kg干燥粉碎的山豆根藥材，加入70%乙醇，浸泡30 min，加熱回流提取1 h，提取2次，合并2次提取液，真空減壓濃縮后，于真空低溫干燥箱干燥得到浸膏，粉碎后得到0.14 kg SDG-Et。

2.1.3 SDG-Et洗脫組分的制備 取100 g SDG-Et，以70%乙醇溶解，分批加入400 g MCI凝膠樹脂中拌樣，揮干溶劑后，裝入上樣柱。取2 kg MCI凝膠樹脂，甲醇浸泡1 h，攪拌均勻，加入 460 mm×70 mm中壓柱，待MCI樹脂沉降均勻后，以超純水替換樹脂中的甲醇溶劑，和上樣柱連接，以Buchi中壓液相色譜儀進(jìn)行中壓柱色譜，分別以10倍柱體積水、40%甲醇、70%甲醇、100%甲醇進(jìn)行柱色譜，分別收集各部位洗脫液，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮干燥，分別得到82.88 g水洗脫組分（SDG-SX）、30.83 g 40%甲醇洗脫組分（SDG-40X）、14.24 g 70%甲醇洗脫組分（SDG-70X）和12.44 g甲醇洗脫組分（SDG-100X）。

2.2 山豆根提取物對(duì)AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞，以2×103/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別精密稱取SDG-SJ和SDG-Et，以DMSO溶解配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液，分別精密稱取SDG-SX、SDG-40X、SDG-70X和SDG-100X，以DMSO溶解配制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的溶液。設(shè)置對(duì)照組、SDG-SJ組、SDG-Et組、SDG-SX組、SDG-40X組、SDG-70X組和SDG-100X組，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，加入100 μL Cell Titer Glo試劑，37 ℃避光振蕩10 min，采用多功能檢測(cè)儀于490 nm檢測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝A給藥/A對(duì)照

2.3 SDG-100X主要化學(xué)成分的鑒定

精密稱取馬卡因2.84 mg和山豆根酮4.60 mg，加入1 mL DMSO超聲溶解，混勻，配制成混合對(duì)照品溶液。采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)SDG-100X的主要化學(xué)成分進(jìn)行表征[20]。

2.4 苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮對(duì)AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

分別精密稱取苦參堿2.48 mg、氧化苦參堿2.64 mg、馬卡因2.84 mg、山豆根酮4.60 mg，加入1 mL DMSO超聲溶解，搖勻，配制成10 mmol/L儲(chǔ)備液，于 ?20 ℃保存，使用前以DMEM稀釋。按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，檢測(cè)A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.5 山豆根酮對(duì)斑馬魚的急性毒性評(píng)價(jià)

2.5.1 最大非致死濃度（maximun non-lethal concentration，MNLC）、10%致死濃度（10% lethal concentration，LC10）和半數(shù)致死濃度（half lethal concentration，LC50）的測(cè)定 隨機(jī)選取240尾2 dpf斑馬魚于6孔板中，設(shè)置對(duì)照組、溶媒組和山豆根酮（2.32、6.95、20.85、33.25、108.55、217.10 μmol/L）組，每組30尾。精密稱取山豆根酮4.60 mg，加入1 mL DMSO超聲使溶解，搖勻，配制成10 mmol/L儲(chǔ)備液，于 ?20 ℃保存，使用時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)稀釋水（含1% DMSO）稀釋。各給藥組加入3 mL相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，溶媒組加入1% DMSO溶液，于（28±2）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每天統(tǒng)計(jì)并及時(shí)移除死亡斑馬魚，記錄各組斑馬魚死亡數(shù)量和毒性情況，采用GraphPad Prism 8.0.1軟件繪制斑馬魚“濃度-死亡率”效應(yīng)曲線，計(jì)算山豆根酮對(duì)斑馬魚的MNLC、LC10和LC50。

2.5.2 急性毒性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取180尾2 dpf斑馬魚于6孔板中，設(shè)置對(duì)照組、溶媒組和山豆根酮（1/9 MNLC、1/3 MNLC、LC10、LC50）組，每組30尾。各給藥組加入3 mL相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入標(biāo)準(zhǔn)稀釋水，溶媒組加入1% DMSO溶液，于（28±2）℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每天于顯微鏡下觀察并記錄斑馬魚毒性發(fā)生情況，移除死亡斑馬魚。給藥結(jié)束后，于顯微鏡下拍照并記錄斑馬魚器官與組織情況，計(jì)算心臟、腦部、眼、肝臟、腎臟、軀干/尾/脊索、運(yùn)動(dòng)能力等毒性發(fā)生率。

2.5.3 斑馬魚肝臟組織病理變化 給藥結(jié)束后，斑馬魚麻醉，用4%多聚甲醛處死，固定過夜，進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，采用HE染色，于顯微鏡下觀察斑馬魚肝臟組織病理變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.1和SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 山豆根提取物對(duì)AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，各給藥組AC16、HK-2細(xì)胞存活率均顯著降低（P＜0.001），SDG-SJ、SDG-40X、SDG-70X和SDG-100X組SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），SDG-SJ和SDG-40X組L-02細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.001），SDG-SX和SDG-100X組L-02細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05、0.001），表明SDG-100X對(duì)細(xì)胞的毒性最強(qiáng)。

圖1 山豆根提取物對(duì)AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 (±s ,n=3)Fig.1 Effect of extracts of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma on survival rate on AC16,L-02,HK-2,and SH-SY5Y cells(±s ,n=3)

3.2 SDG-100X主要化學(xué)成分鑒定

如圖2所示，SDG-Et無生物堿成分，馬卡因和山豆根酮2個(gè)黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為5.46%、8.03%，是山豆根主要的黃酮類成分?？鄥A和氧化苦參堿為山豆根藥材藥典規(guī)定的質(zhì)量控制成分，且為潛在的毒性成分。因此，選擇苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮4個(gè)成分作為山豆根代表性成分進(jìn)行細(xì)胞毒性篩選。

圖2 SDG-100X (A) 和混合對(duì)照品溶液 (B) 的HPLC圖Fig.2 HPLC of SDG-100X (A) and mixed standards solution (B)

3.3 苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮對(duì)AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

如圖3所示，苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮抑制AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞活力，呈劑量相關(guān)性，山豆根酮對(duì)4種細(xì)胞毒性均較強(qiáng)，因此后續(xù)選擇山豆根酮進(jìn)行斑馬魚急性毒性研究。

圖3 苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮對(duì)AC16 (A)、L-02 (B)、HK-2 (B) 和SH-SY5Y (D) 細(xì)胞活力的影響(±s ,n=3)Fig.3 Effect of matrine,oxymatrine,maackiain,and sophoranone on cell viability of AC16 (A),L-02 (B),HK-2 (C),and SH-SY5Y (D) cells (±s ,n=3)

3.4 山豆根酮對(duì)斑馬魚的MNLC、LC10和LC50

如表1所示，給予山豆根酮（2.32、6.95 μmol/L）72 h，無斑馬魚死亡；給予山豆根酮（20.85、33.25、108.55、217.10 μmol/L）72 h，分別有12、27、30、30尾斑馬魚死亡。采用GraphPad Prism 8.0.1軟件擬合，如圖4所示，山豆根酮對(duì)斑馬魚的MNLC、LC10和LC50分別為11.59、15.57、22.45 μmol/L。

表1 山豆根酮對(duì)斑馬魚的死亡率Table 1 Mortality rate of sophoranone on zebrafish

圖4 山豆根酮對(duì)斑馬魚的“濃度-死亡率”曲線Fig.4 “Concentration-mortality rate” curve of sophoranone on zebrafish

3.5 山豆根酮對(duì)斑馬魚的急性毒性

如表2和圖5所示，對(duì)照組和溶媒組斑馬魚卵黃囊基本吸收完全，各臟器均未出現(xiàn)明顯毒性表型，運(yùn)動(dòng)無明顯異常；山豆根酮（1/9 MNLC、1/3 MNLC、LC10）組斑馬魚均未出現(xiàn)死亡，山豆根酮（LC50）組2尾斑馬魚死亡；各劑量山豆根酮組均表現(xiàn)出肝毒性；山豆根酮（1/9 MNLC）組4尾斑馬魚卵黃囊吸收延遲；山豆根酮（1/3 MNLC）組3尾斑馬魚肝臟腫大，6尾斑馬魚卵黃囊吸收延遲；山豆根酮（LC10）組10尾斑馬魚肝臟腫大，1尾斑馬魚肝變性，17尾斑馬魚卵黃囊吸收；山豆根酮（LC50）組15尾斑馬魚肝臟腫大，2尾斑馬魚肝變性，28尾斑馬魚卵黃囊吸收延遲；山豆根酮（LC10、LC50）組均出現(xiàn)心臟毒性，山豆根酮（LC10）組4尾斑馬魚心跳減慢，山豆根酮（LC50）組8尾斑馬魚心包水腫、27尾斑馬魚心跳減慢；山豆根酮（LC10、LC50）組斑馬魚軀干彎曲，可見運(yùn)動(dòng)頻率加快、運(yùn)動(dòng)軌跡異常等行為異常，表現(xiàn)出神經(jīng)毒性。

表2 山豆根酮對(duì)斑馬魚的急性毒性發(fā)生率Table 2 Acute toxicity rate of sophoranone on zebrafish

圖5 山豆根酮對(duì)斑馬魚的毒性典型表型圖Fig.5 Typical toxicity phenotype of sophoranone on zebrafish

綜上，山豆根酮致斑馬魚神經(jīng)毒性表型中行為異常出現(xiàn)濃度為11.59 μmol/L；肝臟毒性表型中卵黃囊吸收延遲出現(xiàn)濃度為1.29 μmol/L，肝腫大出現(xiàn)濃度為3.86 μmol/L；心血管毒性表型中心跳減慢、血流減慢和循環(huán)缺失均為11.59 μmol/L，心包水腫為15.57 μmol/L；腎臟水腫表型出現(xiàn)濃度為15.57 μmol/L；腸道發(fā)育異常出現(xiàn)濃度均為1.29 μmol/L。除上述毒性表型外，各劑量山豆根酮組對(duì)斑馬魚其他組織器官均未觀察到毒性反應(yīng)。以上數(shù)據(jù)表明山豆根酮可能具有潛在肝毒性、心臟毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性和其他毒性。

3.6 山豆根酮對(duì)斑馬魚的肝臟毒性

如圖6所示，對(duì)照組斑馬魚肝臟細(xì)胞輪廓清晰，未見肝臟腫大和空泡，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，細(xì)胞核大小形態(tài)規(guī)則、相互交錯(cuò)；與對(duì)照組相比，山豆根酮（LC50）組肝臟細(xì)胞腫大，可見明顯脂肪樣空泡，但無明顯炎性浸潤(rùn)，表明山豆根酮（LC50）可誘發(fā)斑馬魚肝毒性。

圖6 山豆根酮對(duì)斑馬魚肝臟病理變化的影響 (HE,×200)Fig.6 Effect of sophoranone on liver histological change in zebrafish (HE,× 200)

4 討論

山豆根為常用有毒中藥材，其生物堿類成分如苦參堿和氧化苦參堿是山豆根的有效成分和潛在的毒性成分。然而，近年來研究表明山豆根的非生物堿類成分，尤其是黃酮類成分，有可能也是其潛在的毒性成分之一。山豆根中含有大量的黃酮類成分，尤其黃酮類的代表性成分如馬卡因、山豆根酮在山豆根中含量較高，因此篩選并評(píng)價(jià)黃酮類成分的毒性尤為重要。目前對(duì)于藥物毒性評(píng)價(jià)研究，主要有以細(xì)胞為代表的體外模型和以哺乳動(dòng)物為代表的體內(nèi)評(píng)價(jià)模型。體外細(xì)胞模型用于毒性成分快速、高效的初步篩選，已被廣泛認(rèn)可，但由于毒性作用的復(fù)雜性，體外篩選的結(jié)果需要進(jìn)一步的體內(nèi)毒性研究驗(yàn)證。斑馬魚作為一種新型模式動(dòng)物，其與人類87%的基因組序列高度相似[21]，相比哺乳動(dòng)物，斑馬魚具有體透明易觀察、用藥少、易操作、周期短等特有優(yōu)勢(shì)，逐漸被廣泛應(yīng)用[22-23]。近年來模式生物斑馬魚對(duì)藥物在體內(nèi)肝毒性[22,24]、腎毒性[25]、神經(jīng)毒性[26-27]、心臟毒性[27-28]等早期毒理學(xué)評(píng)價(jià)中應(yīng)用較廣，因其具備細(xì)胞模型高通量篩選的優(yōu)勢(shì)，且兼顧體內(nèi)動(dòng)物模型近似人的整體生物反應(yīng)特點(diǎn)，日益被認(rèn)可[29-30]?；诎唏R魚模型的中藥毒性研究有助于快速得到宏觀毒性靶器官、靶組織，便捷地闡明毒性機(jī)制[23-24,30-32]。

為追蹤鑒定山豆根潛在的毒性成分，本研究從提取物-組分入手，進(jìn)行體外細(xì)胞毒性模型初步篩選，發(fā)現(xiàn)SDG-SJ和SDG-Et均可提高L-02細(xì)胞存活率，表明SDG-SJ和SDG-Et具有一定的肝保護(hù)作用；SDG-Et對(duì)AC16、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞存活率的抑制作用比SDG-SJ強(qiáng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，70%乙醇對(duì)山豆根藥材中的化學(xué)成分提取較完全，包括水溶性大極性成分和脂溶性小極性成分，而水煎煮提取物中的化學(xué)成分主要為水溶性大極性成分，脂溶性小極性成分較少。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)山豆根中的毒性成分可能為脂溶性小極性成分，表明了傳統(tǒng)中藥采用水煎的合理性。SDG-Et的4個(gè)組分對(duì)AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，SDG-100X對(duì)L-02細(xì)胞存活率的抑制作用大于SDG-SX，SDG-40X和SDG-70X可提高L-02細(xì)胞存活率，表明SDG-40X和SDG-70X具有一定的肝保護(hù)作用，且前期研究發(fā)現(xiàn)山豆根生物堿類成分主要集中于SDG-40X，與文獻(xiàn)報(bào)道中的山豆根藥材生物堿類為治療肝炎的主要活性成分相符[33-34]。各組分對(duì)AC16、HK-2和SH-SY5Y細(xì)胞存活率均具有一定的抑制作用，表明山豆根生物堿部位和非生物堿部位均可能是潛在的毒性部位，其中SDG-100X對(duì)4種細(xì)胞存活率的抑制作用最強(qiáng)，推測(cè)其可能為主要的毒性部位，表明山豆根中的脂溶性小極性成分可能是山豆根潛在的毒性成分。分析SDG-100X的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)黃酮類成分馬卡因和山豆根酮是其含量最高的成分。

苦參堿和氧化苦參堿是山豆根的主要有效成分，也是山豆根可能的毒性成分。本研究選擇SDG-100X中的主要成分馬卡因、山豆根酮以及山豆根主要生物堿類成分苦參堿、氧化苦參堿，考察其細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，山豆根酮對(duì)HK-2細(xì)胞活力的抑制作用與苦參堿、氧化苦參堿相近，對(duì)AC16、L-02和SH-SY5Y細(xì)胞活力的抑制作用強(qiáng)于苦參堿和氧化苦參堿，表明山豆根酮也可能是山豆根的潛在毒性成分?；谏蕉垢?個(gè)主要成分的細(xì)胞毒性篩選結(jié)果，選擇山豆根酮展開斑馬魚體內(nèi)急性毒性研究，發(fā)現(xiàn)山豆根酮組斑馬魚毒性表型明顯，主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性（行為異常、軀干彎曲）、肝臟毒性（卵黃囊吸收延遲、肝臟細(xì)胞腫大及脂肪樣空泡、肝腫大）、心血管毒性（心包水腫、心跳減慢、血流減慢、循環(huán)缺失）、腎臟毒性（腎臟水腫）和腸道發(fā)育異常。

綜上所述，本研究結(jié)合山豆根提取物-組分-單體成分的體外細(xì)胞模型毒性篩選結(jié)果，利用斑馬魚模型對(duì)山豆根黃酮類成分山豆根酮的急性毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)山豆根酮能夠誘導(dǎo)斑馬魚肝毒性的發(fā)生，并伴有神經(jīng)毒性、心血管毒性等表現(xiàn)，為山豆根毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步明確提供了數(shù)據(jù)支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突