化肝纖方聯(lián)合恩替卡韋對(duì)慢乙肝肝纖維化患者的血清殼多糖酶3樣蛋白1及臨床療效觀察?

牙程玉，蔣銳沅，胡 曉，吳 聰，毛德文

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧 530023)

肝纖維化是各種病因?qū)е碌穆愿闻K疾病向肝硬化進(jìn)展的中間病理過程，其臨床表現(xiàn)無(wú)特異性或差異較大，主要表現(xiàn)為肝區(qū)不適或脹或痛、疲倦乏力、食欲不振、大便異常等[1]。在我國(guó)，引起肝硬化及肝癌的主要原因是慢性乙型病毒性肝炎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球肝硬化患者中，由乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，HBV)引起的比例為60%[2]，而肝硬化轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟┑?年發(fā)生率為5%～30%[3]，因此抗肝纖維化在延緩疾病進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。有研究顯示，有效的病因治療可逆轉(zhuǎn)肝纖維化甚至早期肝硬化[4]。由此，肝纖維化的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)肝病患者來(lái)說無(wú)疑意義非凡。

迄今，肝纖維化診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍是肝臟穿刺活檢，準(zhǔn)確率可高達(dá)80%，但肝穿具有創(chuàng)傷性、患者難以接受、可重復(fù)率較低等問題，故臨床上難以普及。近年來(lái)研究者們發(fā)現(xiàn)，血清中存在一種大小約40kDa的分泌型蛋白殼多糖酶3樣蛋白1(chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)，它可用于檢測(cè)慢性乙肝患者的肝纖維化程度，并在肝臟中富集表達(dá)，比腎臟、心臟分別高出15.3、276倍[3]。有研究顯示，血清CHI3L1濃度隨肝纖維化的嚴(yán)重程度而逐步上升，并根據(jù)其表達(dá)水平可區(qū)分肝纖維化的不同階段[5]。筆者運(yùn)用CHI3L1的這一特點(diǎn)，以CHI3L1作為主要血清學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察化肝纖方聯(lián)合恩替卡韋治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床療效。

肝纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”“積聚”等范疇，其中“痰濕”“瘀血”是形成肝纖維化的關(guān)鍵性病理產(chǎn)物[6]。廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病中心在肝纖維化治療方面具有獨(dú)到經(jīng)驗(yàn)，在對(duì)肝纖維化病因病機(jī)深入研究的基礎(chǔ)上研發(fā)了化肝纖方，該方是肝病中心積累多年經(jīng)驗(yàn)用于抗肝纖維化的基本方，全方以豁痰化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)為用，通過調(diào)整肝臟功能達(dá)到抗肝纖維化的目的。毛德文、胡振斌等通過觀察化肝纖方治療慢性乙型肝炎肝纖維化45例，表明化肝纖方在改善患者臨床癥狀、肝功能及抗肝纖維化方面均具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值[7]。本研究已獲得廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2018年12月廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科收治入院治療的確診為慢性乙型肝炎合并肝纖維化患者80例，以隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為2組各40例。治療組40例，其中男21例，女19例,年齡36～59歲，平均年齡(48.2±8.4)歲。對(duì)照組40例，其中男23例，女17例，年齡35～63歲，平均年齡(48.3±6.2)歲。2組患者年齡、性別等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。2組患者均按時(shí)完成整個(gè)療程，無(wú)失訪與脫落病例。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2015年由中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)共同制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[2]標(biāo)準(zhǔn)，參照2010年由中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合協(xié)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì)制定的《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[1]標(biāo)準(zhǔn)。在慢性乙型肝炎的基礎(chǔ)上出現(xiàn)肝區(qū)不適或脹或痛、乏力、食欲不振等臨床癥狀；實(shí)驗(yàn)室檢查：肝功能—丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)，兩者均≤2.5倍正常值；AST/血小板比值(AST to platelet ratio index，APRI)<2；肝纖4項(xiàng)、肝臟硬度值(liver stiffness measurement，LSM)均符合上述肝纖維化指南中的診斷。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合協(xié)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì)制定的《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南(2019版)》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)：基本證型氣陰虛損、瘀血阻絡(luò)證，主癥為神疲乏力，肢體倦怠，脅肋、少腹刺痛或脹痛，納呆食少；次癥可兼有口干而苦，時(shí)有惡嘔、大便異常(便溏或大便干結(jié))；舌脈：舌紫暗或有瘀斑瘀點(diǎn)，苔白或白膩，脈弦或弦澀。具備3項(xiàng)主癥或2項(xiàng)主癥伴隨1項(xiàng)次癥，同時(shí)結(jié)合舌脈，由兩名副主任及以上級(jí)別醫(yī)師判定。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡在18～65周歲之間，性別不限；患者均未經(jīng)任何抗肝纖維化治療，或既往接受過抗肝纖維化治療但需經(jīng)過4周洗脫期；Fibrosis 4 Score(FIB-4指數(shù))：[FIB-4指數(shù)=(年齡×AST)÷(血小板×ALT1/2)]在2-4級(jí)病人；ALT、AST≤2.5倍正常值；總膽紅素(Total bilirubin，TBiL)≤2.5倍正常值；乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus-DNA，HBV-DNA)≤9×104IU/mL；體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，BMI)<28 kg/m2(BMI=體質(zhì)量/身高的平方，單位kg/m2)；依從性良好，自愿接受本治療方案并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

不符合上述診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)者；合并其他甲型、丙型、丁型、戊型等急慢性肝炎、肝硬化、肝癌、肝衰竭等病史患者；合并其他器官及造血系統(tǒng)嚴(yán)重的原發(fā)或繼發(fā)疾病和精神病患者；合并艾滋病、結(jié)核病等嚴(yán)重傳染病者；妊娠期及哺乳期婦女。

2 方法

2.1 隨機(jī)原則

本研究采用單盲法將納入的80例患者按隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組和對(duì)照組各40例，2組患者性別構(gòu)成、年齡大小及病程長(zhǎng)短等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 治療方法

2組均給予一般西醫(yī)綜合治療、對(duì)癥處理及恩替卡韋分散片(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20100019)；治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上僅加用化肝纖方(由黃芪20 g、莪術(shù)15 g、丹參15 g、延胡索15 g、三七10 g、海藻10 g、昆布10 g、白芍15 g等組成)，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院煎藥室代煎，每袋150 mL，每日2次，1次150 mL，早晚飯后溫服，療程為8周。

2.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

分別于治療前、治療第4周末、治療后各采集患者清晨空腹靜脈血，3500 r/10 min離心分離血清，置于-70 ℃低溫冰箱中凍存待檢。

2.3.1 2組血清CHI3L1水平 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定，試劑盒購(gòu)于浙江杭州普望生物技術(shù)有限公司，主要步驟：患者清晨空腹抽取靜脈血3 ml，于真空干燥抗凝采血管中靜置30 min后，3500 r/min離心機(jī)離心10 min，吸取上層血清。在96孔板中逐孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清，并順序加入抗體、親和素與顯色劑，于37 ℃恒溫箱中充分孵育與反應(yīng)，待反應(yīng)完成后加入終止液，以酶標(biāo)儀設(shè)置450 mm波長(zhǎng)讀取OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算每孔待測(cè)樣品中濃度值，嚴(yán)格按照說明書完成檢測(cè)。

2.3.2 2組肝功能(ALT、AST、TBiL) 采集患者清晨空腹靜脈血3 ml，離心取血清置于-70 ℃低溫冰箱中待檢；采用全自動(dòng)生化分析儀(日立7600-020)測(cè)定ALT、AST、TBiL值，于治療前、治療第4周末、治療后各檢測(cè)1次。

2.3.3 2組肝纖4項(xiàng) 按上述方法收集患者血清，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光分析儀(邁瑞Mindray CL-2000i)，聯(lián)合化學(xué)發(fā)光法及相關(guān)檢測(cè)試劑，于治療前、治療第4周末、治療后各檢測(cè)1次透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)水平。

2.3.4 乙肝病毒DNA(HBV-DNA)轉(zhuǎn)陰率 使用相關(guān)試劑及PCR熒光法(上海宏石SLAN-96P)測(cè)定治療前、治療第4周末、治療后HBV-DNA水平；HBV-DNA≤102IU/mL為陰性。

2.3.5 肝臟硬度值(liver stiffness measurement，LSM) 患者于清晨空腹或進(jìn)食后2 h，由操作次數(shù)≥500次的醫(yī)師對(duì)患者進(jìn)行FibroScan無(wú)創(chuàng)肝纖維化掃描(FibroScan502超聲診斷儀：JX54700024)，于治療前、治療第4周末、治療后各檢測(cè)1次。

2.3.6 中醫(yī)癥狀評(píng)分 以中醫(yī)癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)2組患者自覺癥狀進(jìn)行采集整理，參考《中藥新藥研究臨床指導(dǎo)原則》[9]中病毒性肝炎常見癥狀分級(jí)量化表的相關(guān)證候及中醫(yī)證候療效判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇主要癥狀為神疲乏力、脅肋疼痛、食欲不振，次要癥狀包括口干而苦、惡心嘔吐、大便異常(便溏或大便干結(jié))的輕重分級(jí)量表。癥狀按照嚴(yán)重程度分為無(wú)、輕、中、重4個(gè)級(jí)別，主要癥狀分別記為“0”“2”“4”“6”分；次要癥狀記為“0”“1”“2”“3”分。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 治療前后血清CHI3L1、肝纖4項(xiàng)水平變化比較

表1示，2組治療前后血清CHI3L1水平、肝纖4項(xiàng)比較。治療8周后，2組血清CHI3L1水平、肝纖4項(xiàng)均較治療前明顯下降(P<0.05)；治療組患者治療后血清CHI3L1及肝纖4項(xiàng)降低水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 2組治療前后血清CHI3L1、肝纖4項(xiàng)比較

3.2 治療前后肝功能(ALT、AST、TBiL)、HBV-DNA變化水平

表2示，2組治療前后肝功能(ALT、AST、TBiL)、HBV-DNA水平比較。治療8周后，2組肝功能(ALT、AST、TBiL)及HBV-DNA均較治療前明顯下降(P<0.05)；治療組患者治療后肝功能(ALT、AST、TBiL)降低水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；治療組治療后HBV-DNA與對(duì)照組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 2組治療前后ALT、AST、TBiL、HBV-DNA比較

3.3 治療前后肝臟硬度值(LSM)、Fibrosis 4 Score(FIB-4指數(shù))變化水平及FibroScan無(wú)創(chuàng)肝纖維化掃描圖

表3圖1示，2組治療前后LSM值、FIB-4指數(shù)比較，治療8周后，2組LSM值、FIB-4指數(shù)均較治療前明顯下降(P<0.05)，治療組患者治療后LSM值、FIB-4指數(shù)降低水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 2組治療前后LSM值與FIB-4指數(shù)比較

注：圖1a為治療組患者治療前運(yùn)用Fibroscan超聲掃描后，其肝臟硬度值(LSM)是8.7 kPa，四分位間距(Interquartile range，IQR)值為0.3，IQR/中值等于7%；圖1b為治療組患者治療8周后，LSM值是6.2 kPa，IQR值為0.7，IQR/中值等于11%。與治療前比較，患者肝臟硬度值下降2.5 kPa(IQR為10次檢測(cè)結(jié)果的四分位間距，IQR/中值指四分位間距除以中位數(shù)值)

3.4 2組中醫(yī)癥狀評(píng)分水平比較

表4示，2組治療前后中醫(yī)癥狀評(píng)分水平比較，治療8周后2組中醫(yī)癥狀評(píng)分較前明顯降低(P<0.05)，治療組治療后中醫(yī)癥狀評(píng)分明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

4 討論

慢性乙型病毒性肝炎仍是威脅人類生命健康安全的重要問題之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染HBV，其中有2.4億為慢性HBV感染者[10]；我國(guó)是肝病大國(guó)，約有高達(dá)9300萬(wàn)人為慢性HBV感染者，若不能有效控制病毒，則會(huì)逐漸演變成慢性肝炎，慢性肝炎經(jīng)久不治，將逐步往肝纖維化、肝硬化、肝癌甚至肝衰竭等預(yù)后較差的疾病發(fā)展，而肝纖維化是在各種慢性肝炎基礎(chǔ)上向肝硬化轉(zhuǎn)變的重要中間環(huán)節(jié)。由此，積極控制、治療肝纖維化無(wú)疑成為延緩或截?cái)嗉膊∵M(jìn)展的良好渠道。

肝纖維化是慢性肝病發(fā)生發(fā)展的中間病理性過程。在慢性肝病向肝纖維化演變進(jìn)程中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)起著至關(guān)重要的作用。肝臟損傷因子誘導(dǎo)并激活肝星狀細(xì)胞，其活化機(jī)制涵蓋多種炎癥因子及細(xì)胞通路，較為復(fù)雜，最經(jīng)典的信號(hào)通路之一是TGFβ/Smad信號(hào)通路[11]，使肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，EMC)分泌增多，降解減少，促進(jìn)慢性肝病向肝纖維化的轉(zhuǎn)化[12]。因此可以推斷，抑制靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞及促進(jìn)活化的肝星狀細(xì)胞的凋亡，對(duì)肝纖維化的拮抗起到一定的促進(jìn)作用，故肝纖維化的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，將為慢性肝病患者保駕護(hù)航，提高患者生活質(zhì)量及生存率。

表4 2組治療前后中醫(yī)癥狀評(píng)分比較(分，

肝纖維化診斷及分期的“金標(biāo)準(zhǔn)”是肝臟組織活檢，而這一有創(chuàng)的檢查技術(shù)不能廣泛地被患者接受，且可重復(fù)率低，在臨床普遍應(yīng)用受到多方面限制，不利于推廣。由此，尋找新的可靠的無(wú)創(chuàng)肝纖維化血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)或?qū)⒊蔀閲?guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)方向。近年來(lái)，CHI3L1作為最新發(fā)現(xiàn)的蛋白，是殼多糖家族中的一員，雖然含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但缺乏幾丁質(zhì)酶活性，在炎癥及組織重塑中發(fā)揮著重要的關(guān)鍵性作用[13]。CHI3L1在肝臟中富集表達(dá)，且可在肝臟枯否細(xì)胞(kupffer cell，KC)中被誘導(dǎo)表達(dá)，從而激活肝星狀細(xì)胞，可能直接參與肝纖維化的生成和維持。CHI3L1的特質(zhì)及大量臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，血清CHI3L1檢測(cè)可作為肝纖維化診斷及分期的重要臨床參考指標(biāo)。在血清CHI3L1的診斷基礎(chǔ)上，聯(lián)合肝纖4項(xiàng)及FIB-4評(píng)分已構(gòu)建的肝纖維化診斷框架，可顯著提高肝纖維化的診斷效能[14]，并將為肝纖維化患者提供又一簡(jiǎn)便、快捷、無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方式，提高血清CHI3L1的臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前尚未有抗肝纖維化的特效西藥，而中西醫(yī)結(jié)合治療抗肝纖維化取得良好的治療效果[15]。肝纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”“積聚”等范疇?！端貑枴づK氣法時(shí)論篇》中說：“肝病者，兩脅下痛引少腹，令人善怒?！薄端貑枴づe痛論篇》言：“寒氣客于厥陰之脈，厥陰之脈者，絡(luò)陰器，系于肝。寒氣客于脈中，則血泣脈急，故脅肋與少腹相引痛矣。”《靈樞·五邪》云：“邪在肝，則兩脅中痛，寒中，惡血在內(nèi)。”《素問·刺熱論篇》中有：“肝熱病者，小便先黃……脅滿痛，手足燥，不能安臥?！薄督饏T翼·積聚統(tǒng)論》[16]中云：“凡憂思欲怒，久不得解者，多成此疾?！薄毒霸廊珪ち〖舱摗穂16]有：“飲食之滯，留蓄于中，或結(jié)聚成塊，或脹滿硬痛，不化不行，有所阻隔者，乃為之積?！薄峨s病源流犀燭·積聚癥瘕痃癖痞源流》[16]說：“壯盛之人，必?zé)o積聚。必其人正氣不足，邪氣留著，而后患此?！庇纱丝蓺w納出，肝纖維化的病因病機(jī)無(wú)外人體正氣虛損，外邪、飲食、情志等因素內(nèi)侵，導(dǎo)致氣、血、痰等凝聚于肝而成此病，臨床可見脅肋部疼痛、少腹疼痛、煩躁、不寐等表現(xiàn)。明·張介賓在《景岳全書·雜證謨》[16]中認(rèn)為，積聚的治療“然欲總其要不過四法，曰攻曰消曰散曰補(bǔ)，四者而已”，又有“肝體陰而用陽(yáng)”的特點(diǎn)。廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病中心在總結(jié)古籍、凝練肝纖維化病因病機(jī)的基礎(chǔ)上，潛心研制化肝纖方，該方以豁痰化瘀、調(diào)整臟腑陰陽(yáng)為主，用藥忌剛宜柔，加用益氣健脾、養(yǎng)陰柔肝之品而成。方中的黃芪[17]、丹參[18]、三七[19]、莪術(shù)[20]等中藥經(jīng)現(xiàn)代研究證實(shí)有減少肝內(nèi)膠原沉積、改善肝臟微循環(huán)、促肝細(xì)胞再生和免疫調(diào)節(jié)等作用，可拮抗肝纖維化進(jìn)程，改善肝纖維化患者臨床癥狀，提高患者的生存質(zhì)量。

基于血清CHI3L1及其他相關(guān)肝纖維化評(píng)判指標(biāo)的研究結(jié)果顯示，化肝纖方在抗肝纖維化方面具有良好的治療效果，能有效延緩肝纖維化的進(jìn)展，甚至在一定程度上可逆轉(zhuǎn)肝纖維化，充分發(fā)揮了中醫(yī)藥在臨床有效治療慢性乙肝相關(guān)肝纖維化的作用，但研究者們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步對(duì)化肝纖方抗肝纖維化的機(jī)制及分子層次進(jìn)行研究探索，以更全面地評(píng)估化肝纖方的有效性及安全性，優(yōu)化治療方案，為臨床廣泛應(yīng)用與推廣中醫(yī)藥治療肝纖維化奠定更完善的前期研究基礎(chǔ)。