疏肝調(diào)神針法對偏頭痛模型大鼠血管活性物質(zhì)和腺苷A1受體表達的影響?

黃紹磊，王蘇瑤，王萌萌，韓 晶,3△，楊佃會,3△

(1. 山東中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，濟南 250014； 2. 濟南市歷下區(qū)人民醫(yī)院，濟南 250014； 3. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南 250011)

偏頭痛是一種常見的慢性、反復發(fā)作的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以單側(cè)或雙側(cè)發(fā)作性、持續(xù)性、搏動性頭痛為主要臨床表現(xiàn)，給患者造成了嚴重的身心傷害，同時加劇了社會經(jīng)濟負擔[1-4]。偏頭痛的病因尚未完全明確，可能與血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫及遺傳等因素有關[5-8]?，F(xiàn)代醫(yī)學尚未有理想的治療方法，多以非甾體抗炎類、曲普坦類、鈣通道拮抗劑等藥物治療以緩解癥狀和預防發(fā)作，但用藥周期長、藥物依賴性嚴重且伴有一定的副作用[9-10]。針刺治療偏頭痛的療效確切[11]。疏肝調(diào)神針法是全國名老中醫(yī)單秋華教授用于治療疼痛類疾病的臨證經(jīng)驗，療效顯著[12-13]。本研究通過觀察疏肝調(diào)神針法對偏頭痛大鼠行為學、外周血中血管活性物質(zhì)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、P物質(zhì)(substance P，SP)及三叉神經(jīng)脊束核中腺苷A1受體(adenosine A1 receptor，ADORA1)基因和蛋白表達的影響，探討其可能的作用機制，為臨床治療提供科學依據(jù)。本研究已通過山東中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康Wistar雄性大鼠32只，體質(zhì)量(200～240) g，購自濟南彭悅公司，生產(chǎn)許可證號scxk魯20140007。于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院SPF級實驗中心飼養(yǎng)操作，控制溫度為20～25 ℃，濕度50%～60%，自由飲水飲食。

1.2 主要試劑及儀器

硝酸甘油注射液(1 ml:5mg，北京益民藥業(yè)有限公司)；Rat 5HT ELISA Kit(CSB-E08364 r)、Rat CGRP ELISA Kit(CSB-E08211 r)、Rat SP ELISA Kit(CSB-E08358 r),武漢華美生物工程有限公司)；ADORA1 Antibody(ab82477,美國abcam公司)；華佗牌針灸針(φ0.3×15 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

PCR儀(IT041-0002，上海依科賽生物制品有限公司)；微量分光光度計(MINIDROP，上海依科賽生物制品有限公司)；超純水儀(1.5 LPM，美國Millipor synergy)；離心機(techcomp CT15RT，北京格瑞恩科技發(fā)展公司)；病理切片機(RM2016型，上海徠卡儀器有限公司)；石蠟包埋機(JB-P5型，武漢俊杰電子有限公司)。

2 方法

2.1 分組

適應性喂養(yǎng)1周后，將32只Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、普通針刺組、疏肝調(diào)神組每組各8只。

2.2 干預方法

各組大鼠每天抓取固定30 min，同時根據(jù)全國普通高等教育中醫(yī)藥類精編教材《實驗針灸學》[14]確定大鼠穴位并進行針刺。疏肝調(diào)神組：選取風池(雙)、百會、太沖(雙)、內(nèi)關(雙)，穿透大鼠皮膚約1～2 mm，百會、風池斜刺；內(nèi)關、太沖直刺，留針30 min。普通針刺組：參照全國普通高等教育中醫(yī)藥類精編教材《針灸治療學》[15]頭痛病癥，選取百會、風池(雙)，操作同上，連續(xù)7 d，第8天造模。

2.3 造模

對照組于大鼠頸后皮下注射0.9%氯化鈉注射液0.5 mg。其余各組均參照經(jīng)典硝酸甘油造模法[16]，于大鼠頸后皮下注射硝酸甘油注射劑(5 mg/kg)，制備實驗性偏頭痛大鼠模型。造模成功標準：造模10～20 min后給藥大鼠出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、雙耳發(fā)紅、咬尾、爬籠次數(shù)增多、往返運動增多等[17]。

2.4 觀察指標及檢測方法

2.4.1 行為學評分 記錄各組大鼠撓頭、咬尾、爬籠、往返運動的次數(shù)，每個癥狀1次記1分，進行行為學評分[13]。大鼠造模前0～30 min第1次評分，30～60 min造模，60～90 min第2次評分，90～120 min抓取固定或針刺，120～150 min第3次評分。

2.4.2 血清5HT、CGRP、SP含量 行為學評分結(jié)束后將大鼠稱重，用10%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉，取腹腔靜脈血5 mL，放入離心機中4℃4000 r/min離心5 min后取血清，使用ELISA試劑盒檢測5HT、CGRP、SP濃度，嚴格按照說明書進行實驗操作。

2.4.3 ADORA1的mRMA表達 熒光定量PCR法檢測三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1的mRMA表達：將大鼠行急性斷頭取腦術(shù)，切取部分三叉神經(jīng)脊束核，加液氮充分研磨，加入1 ml TRIpure LS Reagent，充分吹打混勻。提取RNA，以吸光度法測RNA濃度及純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA模板2 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，2 mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。引物序列：ADORA1：上游5′-CTCTCCGGTACAAGACAGTGGTG-3′；ADORA1：下游5′-CACACTTGATCACGGGCTCC-3′；GAPDH：上游5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′；GAPDH：下游5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR儀中95 ℃預變性10 min，95 ℃變性20 s， 56 ℃退火30 s，72℃20 s延伸，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct計算各組mRNA相對表達量。

2.4.4 ADORA1蛋白表達 免疫組化法檢測三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1蛋白表達：取部分三叉神經(jīng)脊束核置4%多聚甲醛液4 ℃冰箱中固定后，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烘干等步驟制備石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育5～10 min，熱修復抗原，冷卻后PBS洗片1～2次, 加5%正常山羊血清封閉液室溫20 min，加入1∶1000稀釋的ADORA1抗體4°C過夜，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，加辣根酶標記，DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片，400倍顯微鏡下觀察，每張切片選取3個視野，計算陽性細胞累積光密度值。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠行為學比較

表1示，造模前第1次評分各組大鼠行為學比較無差異。造模后第2次評分模型組行為學均較對照組明顯升高(P<0.05)，疏肝調(diào)神組、普通針刺組評分明顯低于模型組(P<0.05)；疏肝調(diào)神組與普通針刺組評分比較略低，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第3次評分疏肝調(diào)神組、普通針刺組明顯低于模型組(P<0.05)，而疏肝調(diào)神組評分略低于普通針刺組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。疏肝調(diào)神組、普通針刺組第3次評分均較第2次評分有明顯降低(P<0.05)。

表1 大鼠行為學評分比較

3.2 各組大鼠血管活性物質(zhì)含量比較

圖1示，與對照組比較，模型組血清5-HT含量明顯降低，SP、CGRP含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，疏肝調(diào)神組和普通針刺組5-HT含量明顯升高，SP、CGRP含量明顯降低(P<0.05)；與普通針刺組比較，疏肝調(diào)神組大鼠血中5-HT、SP、CGRP含量均有明顯改變(P<0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與普通針刺組比較：▲P<0.05

3.3 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1的mRNA表達比較

圖2示，與對照組比較，模型組大鼠三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1的mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，疏肝調(diào)神組、普通針刺組大鼠三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1的mRNA表達均明顯升高(P<0.05)；與普通針刺組比較，疏肝調(diào)神組大鼠三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1的mRNA表達明顯升高(P<0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與普通針刺組比較：▲P<0.05

3.4 各組大鼠三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1免疫組化陽性表達比較

圖3、4示，與對照組比較，模型組大鼠三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1免疫組化陽性細胞累積光密度明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，疏肝調(diào)神組、普通針刺組大鼠三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1免疫組化陽性細胞累積光密度均明顯升高(P<0.05)；與普通針刺組比較，疏肝調(diào)神組大鼠三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1免疫組化陽性細胞累積光密度明顯升高(P<0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與普通針刺組比較：▲P<0.05

圖4 三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1免疫組化陽性細胞(×400)

4 討論

疏肝調(diào)神針法是全國名老中醫(yī)單秋華教授的重要學術(shù)經(jīng)驗，用于治療偏頭痛臨床療效顯著，現(xiàn)已被廣泛應用于各種痛證的治療。本法重視疏肝與調(diào)神，治療偏頭痛時在基礎選穴上加太沖以疏肝，百會、內(nèi)關以調(diào)神。太沖為肝經(jīng)原穴，可疏肝理氣，氣機暢則頭痛止；百會為調(diào)神要穴，可開竅醒神以止頭痛；內(nèi)關為心包經(jīng)絡穴，可寬胸理氣、調(diào)心醒神以治頭痛，諸穴相配增強止痛之效。

三叉神經(jīng)血管學說是目前偏頭痛的主流學說，以硝酸甘油造模可較好地維持痛覺過敏的狀態(tài)，誘導神經(jīng)源性炎性反應，模擬三叉神經(jīng)血管炎性學說[17]。本研究造模后大鼠行為學第2次評分疏肝調(diào)神組、普通針刺組均明顯低于模型組，說明針刺對偏頭痛的發(fā)作具有一定的預防作用；第3次評分疏肝調(diào)神組、普通針刺組明顯低于模型組，且明顯低于第2次評分，說明針刺對偏頭痛的即時鎮(zhèn)痛作用顯著；且此2次評分疏肝調(diào)神組均略低于普通針刺組，差異無統(tǒng)計學意義。猜測其可能由于觀察時間較短及樣本量限制，從行為學觀察疏肝調(diào)神針法較普通針刺優(yōu)勢尚不明顯[13]。

5-HT是經(jīng)典的鎮(zhèn)痛物質(zhì)，大量的實驗揭示了5-HT在痛覺調(diào)制過程中的作用。5-HT作為神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織中廣泛分布。在偏頭痛發(fā)作時，5-HT從血小板中釋放出來，血漿內(nèi)5-HT含量出現(xiàn)一過性升高，隨后其附著于血管壁上，隨即血漿內(nèi)5-HT含量逐漸降低，引起顱內(nèi)血管出現(xiàn)反跳性舒張，進而導致患者出現(xiàn)搏動樣頭痛[18-19]。CGRP是一種具有神經(jīng)細胞保護作用和強大舒血管作用的調(diào)節(jié)肽，其廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，其在外周參與傷害性信號的傳遞及痛覺敏化的形成[20]。研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛發(fā)生時血漿CGRP水平的升高與疼痛程度和持續(xù)時間呈正相關[21]。SP屬速激肽家族中的一種，通過受體與多種第二信使系統(tǒng)偶聯(lián)，發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)與調(diào)質(zhì)的作用，參與痛覺調(diào)制、感覺信息傳遞、神經(jīng)內(nèi)分泌及心血管活動等復雜的生理功能[22]。SP可與其受體結(jié)合引起神經(jīng)細胞興奮、敏感性升高，誘發(fā)神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫作用，刺激中樞的炎性因子的分泌，血管通透性升高，血管擴張而引起神經(jīng)炎性痛，導致偏頭痛的發(fā)作。臨床研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛患者血漿中SP含量明顯高于普通人[23]。本研究中以硝酸甘油造模后，模型組較對照組血中5-HT含量明顯降低，CGRP、SP的含量明顯升高，提示5-HT、CGRP、SP均參與偏頭痛的發(fā)生。針刺后，疏肝調(diào)神組、普通針刺組血中5-HT含量明顯高于模型組，CGRP、SP含量明顯低于模型組，且疏肝調(diào)神組較普通針刺組變化更明顯，提示針刺治療偏頭痛的機制與調(diào)節(jié)5-HT、CGRP、SP含量有關，且疏肝調(diào)神針法對其調(diào)節(jié)作用更顯著，通過5-HT、CGRP、SP共同參與調(diào)節(jié)血管的收縮與舒張，達到鎮(zhèn)痛效果。

腺苷是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)，其通過與特異的受體結(jié)合，參與體內(nèi)多個系統(tǒng)疾病的病理生理過程。研究證實，腺苷對炎性疼痛及神經(jīng)性疼痛均有效，主要通過ADORA1實現(xiàn)。ADORA1廣泛分布于人體各個系統(tǒng)，但在神經(jīng)系統(tǒng)中分布最多?，F(xiàn)有研究表明，ADORA1可通過多種信號傳導通路產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。ADORA1是一種重要的內(nèi)源性信號傳導分子，在各種傷害性刺激發(fā)生時，其通過激活G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)細胞內(nèi)陽離子的跨膜流動，進而影響神經(jīng)元的興奮性與遞質(zhì)的釋放，發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。研究表明，側(cè)腦室注射ADORA1激動劑對硝酸甘油偏頭痛模型大鼠具有明顯鎮(zhèn)痛作用[24-25]。本研究中造模后三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1的mRNA及免疫組化陽性表達均明顯降低，針刺后均明顯升高，且疏肝調(diào)神組較普通針刺組變化更明顯，表明針刺對偏頭痛的治療作用與調(diào)節(jié)三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1的含量有關，且疏肝調(diào)神針法對其調(diào)節(jié)作用更顯著，其鎮(zhèn)痛機制可能是ADORA1與腺苷結(jié)合，在突觸前后發(fā)揮抑制作用，減少傷害性刺激在中樞的傳導，影響神經(jīng)遞質(zhì)及血管活性物質(zhì)的釋放，從而抑制三叉神經(jīng)系統(tǒng)激活，減少神經(jīng)源性炎癥反應及中樞敏化的產(chǎn)生。綜上，疏肝調(diào)神針法對偏頭痛有良好的防治作用，作用機制可能是通過三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)，調(diào)節(jié)三叉神經(jīng)脊束核中ADORA1及血中5-HT、CGRP、SP含量，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，且相較于普通針刺作用更明顯。未來將做進一步研究，深入探討針刺鎮(zhèn)痛的機制。