天香丹減輕大鼠冠脈微血栓及調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號(hào)通路的機(jī)制?

馬學(xué)寬，古麗葛娜·薩吾爾，張 華，辛錦鈺，王思靜，安冬青,2△

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011； 2. 新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011)

冠脈微循環(huán)障礙(coronary microcirculation dysfunction，CMD)是急性冠狀動(dòng)脈綜合征及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)圍術(shù)期常見(jiàn)并發(fā)癥。研究顯示，CMD與冠脈無(wú)復(fù)流或慢血流存在關(guān)聯(lián)且與患者預(yù)后密切相關(guān)，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起著重要作用[1]。天香丹為臨床運(yùn)用30余年的名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，前期研究表明能夠抗自由基損傷，改善缺血再灌注后微循環(huán)障礙，減輕心肌缺血[2]。本研究向左心室內(nèi)注射月桂酸鈉制作大鼠冠脈微循環(huán)障礙動(dòng)物模型，評(píng)估天香丹對(duì)大鼠冠脈微血栓的影響，檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子2 /抗氧化反應(yīng)元件(nuclear factor erythroid-2-related factor 2 / antioxidant response element，Nrf2/ARE)信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)，探究其改善冠脈微循環(huán)障礙的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC-20170222027)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(180±20) g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(新) 2018-003，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)環(huán)境中。

1.2 藥物

天香丹組成：紅景天、新塔花、丹參、降香等，并由新疆華世丹藥業(yè)有限公司制備(批號(hào)18091201，每袋9 g，含生藥量3.125 g)；尼可地爾(批號(hào)N0837，上海梯希愛(ài)公司)。

1.3 試劑及儀器

戊巴比妥鈉(批號(hào)P3761)，Sigma公司；月桂酸鈉(批號(hào)BCBBV3875)，Sigma公司；蘇木素(批號(hào)ZLI-9610)，中杉金橋公司；伊紅(批號(hào)ZLI-9613)，中杉金橋公司；馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(lán)(批號(hào)G2040)，索萊寶公司；Nrf2(批號(hào)E-AB-33607)，伊萊瑞特公司；Keap1(bs-4648R)、NQO1(bs-23407R)，博奧森公司；正常山羊血清工作液(批號(hào)ZLI-9028)、兔SP試劑盒(批號(hào)SP-9001)，中杉金橋公司；DAB顯色試劑盒(批號(hào)ZLI-9018)；飛利浦HD11XE超聲診斷儀；泰盟HX-300S動(dòng)物呼吸機(jī)，JEM-100CXII型透射電子顯微鏡。

2 方法

2.1 動(dòng)物建模及分組

SPF級(jí)雄性成年SD大鼠27只，體質(zhì)量180±20 g腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉、備皮、消毒后氣管插管以輔助通氣。開(kāi)胸暴露心臟及主動(dòng)脈根部，使用一次性1 mL BD胰島素針刺入左心室(以有回血為準(zhǔn))，迅速注入2 mg/kg月桂酸鈉，同時(shí)夾閉主動(dòng)脈升部與主動(dòng)脈弓連接處10 s，關(guān)胸復(fù)蘇、喂養(yǎng)。術(shù)中全程無(wú)菌操作，術(shù)后腹腔注射青霉素3 d預(yù)防感染。術(shù)后將存活下的手術(shù)大鼠隨機(jī)分為模型組、尼可地爾組、天香丹組，并設(shè)空白對(duì)照組大鼠9只。

2.2 給藥劑量

大鼠給藥劑量g/(kg·d)=成人每日劑量(g)×大鼠體表面積/人體表面積[3]，天香丹組大鼠給予 0.9408(X)2/3g/d 天香丹顆粒灌胃。尼可地爾組給予 0.7840(X)2/3mg/d 尼可地爾溶入生理鹽水中灌胃，X代表大鼠體質(zhì)量kg；空白對(duì)照組、模型組給予每日灌胃生理鹽水，每只大鼠給藥體積均為2 mL/d。自大鼠術(shù)后第二天開(kāi)始，每日給藥 1 次，每周按體質(zhì)量調(diào)整給藥量，共給藥28 d。各組大鼠均自由飲水飲食，不限制活動(dòng)。

2.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

給藥28 d后，在全身麻醉的狀態(tài)下將其固定后行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。大鼠胸前區(qū)備皮，涂以耦合劑，超聲探頭對(duì)準(zhǔn)胸部第3、4肋間掃描，以M型超聲心動(dòng)圖連續(xù)測(cè)量 3 個(gè)不同心動(dòng)周期左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)并取平均值。按照公式左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)=(左室舒張末期內(nèi)徑3-左室收縮末期內(nèi)徑3)/左室舒張末期內(nèi)徑3×100得到各組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)以評(píng)價(jià)心功能。

2.4 光鏡檢查

超聲心動(dòng)圖檢測(cè)完成后大鼠開(kāi)胸取出心臟，修剪去除心耳及主要大血管，沿心臟中線切為一半，投入中性甲醛溶液中固定48 h。石蠟包埋后，將組織切成4 μm厚的切片，行HE染色及馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(lán)染色，觀察微血栓的形成。

2.5 透射電鏡檢查

取大鼠心肌組織，4 ℃下修剪為約1 mm3的組織塊，2.5%戊二醛固定液中固定24 h，經(jīng)過(guò)脫水、滲透、包埋制成切片，染色后透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

2.6 免疫組化檢測(cè)

采用免疫組化法檢測(cè)心肌組織中核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)、醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]的表達(dá)。一抗稀釋倍數(shù)為Nrf 2(1:50)、Keap1(1∶50)、NQO1(1-50)。每組切片中任選1張作為陰性對(duì)照，使用 0.01 mol/L PBS代替一抗進(jìn)行染色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，以細(xì)胞胞漿、胞質(zhì)、胞核中出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒判斷有陽(yáng)性反應(yīng)，采用Image pro plus軟件進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 心功能檢測(cè)

表1示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠LVEDD、LVEF均降低(P<0.05)；與模型組比較，尼可地爾組LVEF升高(P<0.05)，天香丹組LVEDD、LVEF升高(P<0.05)，天香丹組與尼可地爾組LVEDD、LVESD、LVEF比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠心功能比較

3.2 心肌組織病理學(xué)變化

圖1示，HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)微血栓，偶爾可見(jiàn)少量紅細(xì)胞。模型組大鼠冠脈微血管內(nèi)分布著由紅細(xì)胞、血小板和纖維蛋白構(gòu)成的紅色或白色血栓混合物，并可見(jiàn)心肌細(xì)胞纖維化。與模型組比較，尼可地爾組、天香丹組微血栓程度均有不同程度減輕，心肌排列正常。

圖2示，馬休黃-酸性品紅-苯胺藍(lán)染色顯示，冠脈微血管內(nèi)微血栓的成分多由紅色纖維素和藍(lán)色纖維蛋白組成。空白對(duì)照組未見(jiàn)微血栓，模型組栓塞程度較重，尼可地爾組及天香丹組微血管內(nèi)血栓均有不同程度減輕。

注：a.空白對(duì)照組；b.模型組；c.模型組心肌細(xì)胞；d.尼可地爾組；e.天香丹組；f.天香丹組心肌細(xì)胞

3.3 透射電鏡觀察

圖3示，空白對(duì)照組透射電鏡圖像可見(jiàn)心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)良好。模型組可見(jiàn)心肌細(xì)胞閏盤(pán)間隙過(guò)大，心肌細(xì)胞破裂，線粒體絮狀改變，內(nèi)部復(fù)雜性降低，并可看到Z線明顯不平。尼可地爾及天香丹治療后減輕了線粒體損傷，心肌細(xì)胞排列較整齊，Z線略平，閏盤(pán)正常。

3.4 免疫組化檢測(cè)

圖4表2示，與空白對(duì)照組比較，模型組Keap1表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，天香丹組及尼可地爾組Keap1表達(dá)均降低(P<0.05)，天香丹組Nrf2、NQO1表達(dá)升高(P<0.05)。與尼可地爾組比較，天香組Nrf2、NQO1表達(dá)均升高(P<0.05)。

4 討論

冠脈微循環(huán)障礙是指在多種因素的作用下，冠狀前小動(dòng)脈和小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)與(或)功能異常所致勞力性心絞痛或心肌缺血的臨床綜合征[4]。研究發(fā)現(xiàn)，冠脈微循環(huán)障礙可表現(xiàn)為冠脈無(wú)復(fù)流、慢復(fù)流、X綜合征、缺血再灌注損傷等[5-6]。月桂酸鈉具有強(qiáng)烈的內(nèi)皮損傷作用，可造成血管內(nèi)皮的脫落甚至穿孔。本研究使用月桂酸鈉作為內(nèi)皮損傷劑行左心室內(nèi)注射制作冠脈微循環(huán)障礙動(dòng)物模型，更貼近臨床病理生理實(shí)際情況[7]。

注：a.空白對(duì)照組；b.模型組；c.模型組心肌細(xì)胞；d.尼可地爾組；e.天香丹組；f.天香丹組心肌細(xì)胞

注：En.血管內(nèi)皮(vascular endothelial)；Er.紅細(xì)胞(red blood cell)；M.線粒體(mitochondrion)；Id.閏盤(pán)(intercalated disc)注：a.空白對(duì)照組；b.模型組；c.模型組閏盤(pán)；d.尼可地爾組；e.天香丹組；f.天香丹組閏盤(pán)

注：a.空白對(duì)照組；b.模型組；c.尼可地爾組；d.天香丹組

表2 各組大鼠心肌免疫組化染色中IOD值比較

心臟超聲心動(dòng)圖檢測(cè)LVEF值能夠準(zhǔn)確反映大鼠的心臟功能，在不使用侵入性方式或放射性示蹤劑的情況下，超聲心動(dòng)圖是非侵入性冠狀動(dòng)脈血流評(píng)估的替代方案之一[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠LVEF降低，尼可地爾組及天香丹組大鼠心功能恢復(fù)正常。結(jié)合文獻(xiàn)及本研究結(jié)果，其可能的原因?yàn)楣诿}微血管內(nèi)出現(xiàn)微血栓，伴隨心肌發(fā)生纖維化，心肌細(xì)胞缺血缺氧導(dǎo)致心功能降低。尼可地爾及天香丹能夠改善心肌缺血，從而提高心功能[10-11]。

研究表明，Nrf2及其下游NQO1的表達(dá)上調(diào)是激活Nrf2/ARE信號(hào)通路的標(biāo)志[12-14]。當(dāng)發(fā)生過(guò)氧化時(shí)Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，解離的Nrf2進(jìn)入胞核，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，調(diào)控下游抗氧化元件NQO1。NQO1能夠還原醌類(lèi)及其衍生物，阻止其產(chǎn)生活性氧并降低其毒性，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[15-16]。中西藥都可通過(guò)Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮改善微循環(huán)障礙的作用。如齊欣[17]研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血藥能通過(guò)激活Nrf2/ARE通路表達(dá)，并達(dá)到改善冠脈微循環(huán)障礙的作用。白雪思等[18]發(fā)現(xiàn)，川芎嗪聯(lián)合卡波金通過(guò)上調(diào)Nrf2的磷酸化程度、下調(diào)Keap1的表達(dá)而發(fā)揮抗氧化作用，改善微循環(huán)障礙。本研究中，與模型組比較天香丹組Nrf2及其下游NQO1的表達(dá)增強(qiáng)，從而證實(shí)天香丹激活Nrf2/ARE信號(hào)通路。

冠脈微循環(huán)障礙屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”等范疇。研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪、麝香保心丸等中藥提取物或中成藥均能改善微循環(huán)，提高組織灌注水平[19-23]。天香丹為“通補(bǔ)開(kāi)泄法”治療冠心病的代表方。前期研究表明，可改善冠心病患者的胸悶、胸痛、心悸等癥狀[24]。本研究顯示，冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生時(shí)，微血管內(nèi)出現(xiàn)微血栓，心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。天香丹能夠減輕月桂酸鈉誘導(dǎo)的冠脈微血管內(nèi)血栓程度，上調(diào)Nrf2、NQO1的表達(dá)，對(duì)Nrf2的負(fù)調(diào)控因子Keap1產(chǎn)生抑制作用。這可能與激活Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)。

本研究闡釋了天香丹改善冠脈微血栓、提高心功能的機(jī)制，為天香丹防治冠脈微循環(huán)障礙提供理論依據(jù)。本研究還需進(jìn)一步從天香丹是否調(diào)控Nrf2/ARE信號(hào)通路下游因子的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，而改善冠脈微循環(huán)障礙進(jìn)行探討。