基于基因組高通量測序的腦膠質(zhì)瘤組織中差異表達長鏈非編碼RNA篩選及驗證

高元峰，王瑞穎，易柳，李珊，肖望重

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)

膠質(zhì)瘤為中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一［1］，其發(fā)病年齡多見于20～50歲，以30～40歲為最高峰，另外在10歲左右兒童中亦較多見?；颊叨啾憩F(xiàn)為頭痛、惡心嘔吐、癲癇、視物模糊等癥狀，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡。臨床上，膠質(zhì)瘤以星形細(xì)胞瘤最為常見，其次是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和室管膜瘤［2-3］。2016版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)引入了分子學(xué)特征，構(gòu)建了分子時代中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷的新理念［4］。然而目前作為診斷的特定基因數(shù)量有限，如p53、IDH-1、GFAP、EGFR等，未知且重要的基因靶點仍有待開發(fā)，探討新的分子靶標(biāo)是膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)研究和臨床治療的新契機。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究顯示，在多種細(xì)胞生理過程中，lncRNA與關(guān)鍵組件的基因或蛋白質(zhì)相互作用，改變基因表達或蛋白的一級或二級結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［5-7］。目前共有20多個異常表達的lncRNA被證實與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如HOXA11-AS、Linc-POU3F3和HULC等［8-9］，然而還有許多未知的lncRNA及其功能尚未明確。本研究采用高通量測序法篩選膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中存在差異表達的lncRNA，并進一步擴大樣本進行驗證，旨在尋找新的膠質(zhì)瘤生物標(biāo)志物，為膠質(zhì)瘤的早期診斷和治療提供新的靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月—2019年12月在中南大學(xué)湘雅附屬腫瘤醫(yī)院行手術(shù)切除的89例腦膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織，25例腦外傷患者的腦組織樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：藥物治療前未進行過放療或生物療法的膠質(zhì)瘤患者及腦外傷患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有非神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤；合并肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病及心血管疾??；肝腎功能不全；懷孕或哺乳期婦女。本研究經(jīng)臨床倫理機構(gòu)審查委員會審核并批準(zhǔn)（注冊號：ChiCTR1800019217）。

1.2 腦膠質(zhì)瘤組織中l(wèi)ncRNA高通量測序 采用LncRNA-Seq基因組高通量測序法。取19例腦膠質(zhì)瘤組織和5例腦外傷組織，提取組織總RNA，去除rRNA。制備缺失rRNA的RNA特異性文庫。使用隨機引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶Ⅰ和RNase H合成cDNA。將DNA片段腺苷酸化后，進行雜交，用Ampre XP系統(tǒng)（Beckman Coulter，Beverly，MA）純化文庫片段，再利用Illumina HiSeq進行雙端測序，測序工作由北京博奧生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 腦膠質(zhì)瘤組織中差異表達lncRNA的篩選 應(yīng)用edgeR軟件分析膠質(zhì)瘤組織與腦外傷組織差異表達的lncRNA，獲得P值后進行兩輪多重假設(shè)檢驗校正，通過控制錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來決定P值的閾值，校正后的P值即Q值。采用FPKM公式計算差異倍數(shù)（FC）。以P<0.05、FC≥2或≤0.5為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達的lncRNA。計算歐式距離矩陣，以完全連鎖方法對差異lncRNA進行聚類，以聚類圖進行展示。將篩選出的差異表達lncRNA以火山圖的形式進行可視化。

1.4 腦膠質(zhì)瘤組織中差異表達lncRNA的驗證 采用qPCR法對上述篩選出的部分差異lncRNA進行驗證。選取膠質(zhì)瘤組織70例和正常腦組織20例，加入TRIzol試劑提取總RNA，采用超微量核酸分析儀（NANODrop2000，日本島津公司）測定RNA濃度和純度，滿足A260/A280在1.8～2.0。以提取的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用實時熒光定量PCR儀（7300 plus，美國ABI公司）進行實時定量擴增。SYBR反應(yīng)體系（20μL）：gDNA 10.0μL，5×Prime script Buffer 4.0μL，Prime Script RT Enzyme MixⅠ1.0μL，RT primer Mix 1.0μL，RNase free H2O補足至20μL。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。取所有樣本最終Ct值的平均值。根據(jù)熔解曲線分析引物的特異性，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料先行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的采用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織中差異表達lncRNA的篩選結(jié)果 根據(jù)高通量測序結(jié)果，基于lncRNA表達矩陣，繪制聚類圖，見OSID碼。橫坐標(biāo)代表不同分組，N為腦外傷組織，T為腦膠質(zhì)瘤組織；紅色表示該lncRNA含量高表達，藍(lán)色表示該lncRNA含量低表達。結(jié)果表明兩組lncRNA表達存在明顯差異。為將差異lncRNA可視化，以FC變化為橫坐標(biāo)，以P值變化的統(tǒng)計學(xué)意義為縱坐標(biāo)，按前述差異基因篩選條件（P<0.05、FC≥2或≤0.5），繪制火山圖，見OSID碼。與腦外傷組織相比，膠質(zhì)瘤組織中存在明顯差異表達的lncRNA共3 040個，其中表達上調(diào)1 233個、表達下調(diào)1 807個。差異表達的lncRNA按FC排序，前10位分別見表1。

2.2 腦膠質(zhì)瘤組中中部分差異表達lncRNA的驗證結(jié)果 對腦膠質(zhì)瘤組織中表達上調(diào)和下調(diào)前3位的lncRNA進一步擴大樣本量進行驗證，PCR引物設(shè)計序列見表2。結(jié)果顯示，與正常腦組織比較，腦膠質(zhì)瘤組織中TCONS_00 0 1 09 6 1、ENST 0 0 0 00 4 4 35 4 6.1、ENSG00000262119.1表達升高，ENST00000531508.1、TCONS_00004034、ENST00000504876.1表 達 降 低（P<0.05或<0.01），與基因組高通量測序結(jié)果一致。見表3。

表1 腦膠質(zhì)瘤組織中差異表達的lncRNA（前10位）

表2 lncRNA引物序列（5'→3'）

表3 部分差異表達lncRNA的驗證結(jié)果

3 討論

非編碼RNA指的是不編碼蛋白質(zhì)的RNA，大部分屬于“管家RNA”或“監(jiān)管RNA”。非編碼RNA與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其在腫瘤的預(yù)測、診斷及治療預(yù)后等方面具有重要價值，成為近年來國內(nèi)外研究的熱點之一［10-12］。lncRNA是指長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其功能主要涉及以下4個方面：①表觀遺傳調(diào)控：如lncRNA ZEB1-AS1啟動子區(qū)具有低甲基化現(xiàn)象［13］；lncRNA Xist能促進染色質(zhì)修飾復(fù)合物的表達［14］；lncRNA HOTAIR能調(diào)整母體基因HOXD在HOXD基因簇的空間位置［15］。這些表觀遺傳調(diào)控能直接或間接影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。②基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：如lncRNA TSLC1-AS1能與其母體的TSLC1 mRNA形成復(fù)合體，增加母體mRNA的穩(wěn)定性，避免被酶解，從而影響TSLC1蛋白表達［16］。③蛋白水平調(diào)控：非編碼RNA不具有編碼蛋白的能力，但可以調(diào)控某些蛋白的活性。如lncRNA FOXD1-AS1能結(jié)合到eIF5a蛋白的特定結(jié)構(gòu)域，影響其活性，從而影響eIF3a蛋白的表達水平［17］。④miRNA競爭調(diào)控：如lncRNA TUG1的功能與miR-21有關(guān)，并通過lncRNA-miRNA-mRNA軸發(fā)揮作用［18-19］。

本研究通過基因組高通量測序方法，篩選出膠質(zhì)瘤組織中差異表達的lncRNA共3 040個，其中表達上調(diào)1 233個、表達下調(diào)1 807個。這些差異表達的lncRNA可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)。為了驗證基因組高通量測序結(jié)果，我們進一步擴大了樣本量，利用qPCR法檢測腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中TCONS_00010961、ENST00000443546.1、ENSG0 0 0 0 02 6 2 11 9.1、ENST 0 0 0 00 5 3 15 0 8.1、TCONS_00004034、ENST00000504876.1的表達情況，結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤組織中前3個lncRNA表達顯著升高、后3個lncRNA表達顯著下降，與測序結(jié)果一致。

綜上，本研究利用基因組高通量測序初步篩選出膠質(zhì)瘤組織中差異表達的lncRNA，并進一步擴大樣本進行驗證，二者結(jié)果相符。本研究發(fā)現(xiàn)了更多未知的與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的lncRNA，但作為臨床標(biāo)志物可能還存在一定的局限性，無法真正應(yīng)用于臨床，且不同地區(qū)、不同種族之間是否具有同樣的差異尚未可知。下一步我們將從細(xì)胞凋亡、自噬等方面進行膠質(zhì)瘤細(xì)胞實驗，尋找與lncRNA相關(guān)的miRNAs以及相關(guān)靶基因。