PKD2在骨髓間充質干細胞成脂分化過程中的表達變化及作用

單麗英，吳曉文，師曉麗，朱恩東，袁海瑞，王寶利

1天津醫(yī)科大學朱憲彝紀念醫(yī)院天津市內分泌研究所 國家衛(wèi)健委激素與發(fā)育重點實驗室，天津300134；2天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院

骨髓間充質干細胞（BMSCs）在特定條件誘導下可以向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞、成肌細胞等細胞分化［1］。BMSCs向脂肪細胞和成骨細胞分化的過程中存在一種平衡關系，當此平衡被打破時，將導致相關疾病的發(fā)生［2-4］。例如，當成脂分化占優(yōu)勢時會削弱BMSCs向成骨細胞分化的能力，從而引起骨質疏松、與年齡相關的骨丟失等疾?。?-7］。因此，闡明成脂分化和成骨分化之間的平衡關系對骨質疏松等代謝性疾病的治療有著重要意義。多囊腎致病基因2（PKD2）突變會導致常染色體顯性遺傳性多囊腎病（ADPKD）的發(fā)生。MESNER等［8］發(fā)現(xiàn)PKD2可以促進BMSCs向成骨細胞分化，但研究未涉及PKD2調控BMSCs向脂肪細胞分化的作用。2019年6月—2020年6月，本研究以骨髓間充質干細胞系ST2作為實驗對象，探討PKD2對BMSCs成脂分化的作用及可能的調控機制，旨在為骨代謝相關代謝性疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 ST2細胞為本實驗室保存。無內毒素質粒小提試劑盒購自CWBIO公司；限制性內切酶（NheⅠ、EcoRⅠ）、Opti-MEM、逆轉錄試劑盒購自Thermo Fisher公司；ClonExpress?Ⅱ重組克隆試劑盒購自Vazyme Biotech公司；引物合成、測序由Sangon Biotech公司完成。α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司；轉染試劑Attrac?tene Transfection Reagent購自QIAGEN公司；總RNA提取試劑盒購自GeneMark公司；胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購自Sigma公司；吲哚美辛購自Cyagen公司；油紅O染液購自Sigma公司。倒置顯微鏡購自Olympus公司。

1.2 ST2細胞成脂分化過程中PKD2表達觀察 當ST2細胞匯合度達100%時，進行成脂誘導。使用含有α-MEM培養(yǎng)基（含1%雙抗、5%胎牛血清）、0.5μmol/L地塞米松、0.25 mmol/L IBMX、5 mg/L胰島素、50μmol/L吲哚美辛的成脂誘導培養(yǎng)基誘導72 h，之后更換只含5 mg/L胰島素的α-MEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)誘導。采用qRT-PCR法分別檢測成脂分化誘導0、1、2、3、4、5 d時細胞中的PKD2基因。

1.3 PKD2基因過表達質粒的構建 根據(jù)NCBI Ge n e b a n k數(shù)據(jù)庫中PKD2基因序列設計PCR擴增引物。PKD2上游引物序列為5'-CTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCAT?GGTTAACTCCAGACGCGT-3'，下游引物序列為5'-CACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTAG?GCATGGACGTTGGCAC-3'。以C57BL/6小鼠肝臟cDNA為模板，按照95℃預變性2 min，95℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸150 s共30個循環(huán)，72℃延伸10 min進行PCR擴增。將擴增產(chǎn)物和經(jīng)過NheⅠ/EcoRⅠ雙酶切的pcDNA3.1用試劑盒純化回收，然后將二者通過ClonExpress?Ⅱ重組克隆試劑盒進行重組反應（37℃、30 min），將重組產(chǎn)物轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，之后涂板于LB固體培養(yǎng)基（含有100μg/mL氨芐青霉素）上，37℃培養(yǎng)16 h，次日挑取單菌落，搖菌過夜后提取質粒，用NheⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定，進行一代測序，鑒定正確的菌種即PKD2基因過表達質粒。

1.4 ST2細胞的培養(yǎng)及分組處理 轉染前1 d，將ST2細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，待細胞匯合度達60%~80%時進行轉染。將ST2細胞分為對照組和實驗組，分別取pcDNA3.1與PKD2過表達質粒稀釋于Opti-MEM，靜置5 min后加入適量轉染試劑Attractene，靜置15~20 min。24孔板中每孔滴加轉染混合物50μL，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染16~18 h后更換新的α-MEM完全培養(yǎng)基。

1.5 ST2細胞的成脂分化誘導及鑒定 兩組細胞匯合度達100%時，進行成脂誘導。待脂滴成熟后，采用油紅O染色進行鑒定：用4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min；1×PBS洗滌1次；加入適量60%異丙醇，1 min后棄去；最后加入適量油紅O染液，室溫靜置5 min后用蒸餾水沖洗干凈；倒置顯微鏡下觀察細胞分化情況并拍照；每孔加100%異丙醇200μL萃取油紅O，采用多功能酶標儀測定OD520，表示油紅O的著色程度，定量分析各組間脂滴差異。

1.6 成脂分化相關基因及蛋白檢測 采用qRTPCR法檢測成脂分化相關基因［過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）、CCAAT增強子結合蛋白α（C/EBPα）、脂 肪 酸 結 合 蛋 白4（FABP4）、adip?sin mRNA］。成脂誘導48 h后收集細胞提取總RNA，用Thermo逆轉錄試劑盒逆轉成cDNA，然后進行qRT-PCR反應。反應體系：模板cDNA 2μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 5μL，去離子水補充至10μL。反應條件：95℃預變性3 min，95℃5 s、56℃15 s、72℃15 s共35個循環(huán)。以β-actin為內參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。采用Western blotting法檢測成脂分化相關蛋白（PPARγ、C/EBPα、FABP4）。兩組細胞成脂誘導72 h后用RIPA裂解液裂解，在4℃條件下，12 000 r/min離心10 min，取上清液置于新的離心管中，即為總蛋白。配制10%SDS-PAGE凝膠，將獲得的總蛋白加到凝膠的孔里進行蛋白電泳，恒壓60 V至蛋白進入分離膠，將電壓調至120 V至電泳結束。250 mA恒流將蛋白轉印至NC膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃下加一抗過夜，次日加二抗后曝光，用Image J軟件進行灰度值分析，并計算相關蛋白與β-actin的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7 Wnt信號通路相關蛋白檢測 將ST細胞分為對照組和實驗組，分別轉染pcDNA3.1與PKD2過表達質粒，不進行成脂誘導處理，轉染后72 h采用Westeren blotting法檢測Wnt信號通路相關蛋白（t-Lrp6、p-Lrp6、t-GSK3β、p-GSK3β、t-β-catenin、活化β-catenin、TCF7L2）。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ST2細胞成脂分化過程中PKD2基因表達 成脂分化誘導后0、1、2、3、4、5 d的ST2細胞中PKD2基因相對表達量分別為1.00±0.19、3.04±0.16、3.02±0.10、2.70±0.88、4.57±1.03、4.45±0.90，成脂分化誘導1 d以后PKD2基因相對表達量均顯著高于0 d時，以誘導4 d時PKD2基因相對表達量最高（P均<0.05）。

2.2 PKD2對ST2細胞成脂分化的影響 實驗組形成的脂滴數(shù)目顯著減少。實驗組、對照組油紅定量分別為0.18±0.01、0.42±0.05，實驗組低于對照組（P<0.05）。

2.3 PKD2對ST2細胞成脂分化相關基因和蛋白表達的影響 實驗組細胞中PPARγ、C/EBPα、FABP4、adipsin mRNA表達低于對照組；PPARγ、C/EBPα、FABP4蛋白表達低于對照組（P均<0.05）。見表1。

表1 實驗組和對照組細胞中PPARγ、C/EBPα、FABP4、adipsin mRNA及蛋白表達比較（±s）

表1 實驗組和對照組細胞中PPARγ、C/EBPα、FABP4、adipsin mRNA及蛋白表達比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05。

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2.4 PKD2對Wnt信號通路相關蛋白表達的影響實驗組細胞中p-Lrp6、p-GSK3β、活化β-catenin、TCF7L2蛋白表達均高于對照組（P均<0.05）。見表2。

表2 實驗組與對照組Wnt信號通路相關蛋白表達比較（±s）

表2 實驗組與對照組Wnt信號通路相關蛋白表達比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05。

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3 討論

在生理條件下，BMSCs具有向骨、軟骨和脂肪等組織分化的潛能，這對于維持骨髓內骨組織及脂肪組織數(shù)量的平衡具有重要意義。BMSCs向脂肪細胞或成骨細胞的分化存在一種動態(tài)平衡。在衰老過程中，BMSCs向脂肪細胞分化具有偏向性，隨著脂肪組織的積累，骨髓中骨的形成減少。而BMSCs向脂肪細胞的分化是一個復雜、高效的調控過程，需要多個信號通路、多種轉錄因子的參與。研究發(fā)現(xiàn)，在基質干細胞脂肪分化過程中，PPARγ和C/EBPα表達較高［9］，是脂肪生成的重要早期調節(jié)因子，二者協(xié)同作用可以激活下游FABP4等脂肪生成基因的轉錄，從而誘導形成成熟脂肪細胞［10-11］。

PKD2位于人染色體4q21-23，由15個外顯子組成，編碼一個由968個氨基酸構成的6次跨膜蛋白［12］。有研究證實PKD2基因突變后蛋白的表達缺失會導致ADPKD的發(fā)生，主要表現(xiàn)為雙側腎臟形成多個大小不等的圓球形液性囊腫［13］，造成腎臟功能不可逆性損傷，最終導致腎衰竭［14-16］。PKD2在成人和胎兒的大多數(shù)組織中表達［17］，其在心血管系統(tǒng)中的表達水平較高，在血管壁平滑肌細胞和內膜細胞中含量也比較豐富，有助于心血管功能的維持和穩(wěn)定［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，PKD2作為雙尾基因1的下游基因，可促進BMSCs向成骨細胞分化、增加骨密度［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，ST2細胞成脂分化過程中PKD2的表達增高，表明PKD2可能在BMSCs向脂肪細胞分化過程中發(fā)揮調控作用。然后我們構建了PKD2過表達質粒，在ST2細胞中進行轉染。經(jīng)成脂誘導后，與轉染pcDNA3.1質粒的對照組相比，實驗組脂滴的數(shù)目顯著減少，與成脂分化有關的調控因子PPARγ、C/EBPα、FABP4、adipsin mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，同時發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達水平增加。

Wnt/β-catenin信號通路參與調控多種生命發(fā)育過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、遷移以及成人干細胞的維持［19-20］。當激活信號傳來，Wnt與Frizzled結合成復合物，GSK-3β磷酸化，使得β-catenin不能被降解，從而能夠進入胞核與核內轉錄因子TCF/LEF形成TCF/LEF/β-catenin復合體，特異性激活下游靶基因，發(fā)揮調控作用。當前多數(shù)學者認為Wnt/β-catenin信號通路在調控脂代謝、骨發(fā)育及骨代謝的生理過程中發(fā)揮重要作用［21］。Wnt/β-catenin信號通路可以抑制成脂分化［22］，促進成骨分化。有研究表明，通過Wnt3a激活的經(jīng)典Wnt通路可以抑制成脂分化過程中主要轉錄因子PPARγ和FABP的表達，Wnt10b能抑制PPARγ和C/EBPα的表達，從而抑制成脂分化［19］。因此，結合本研究的發(fā)現(xiàn)，我們認為，PKD2可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路從而抑制BMSCs向脂肪細胞的定向分化。但關于PKD2調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路的具體途徑仍需要明確。

經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路參與了ADPKD的形成［13］。早期研究顯示，在體外，PKD1和PKD2的結構域相互關聯(lián)［23］。小鼠胚胎成纖維細胞分泌的Wnt可作為PKD1/PKD2復合物活化的配體，破壞復合物的形成；減少PKD1的表達或降低PKD2的活性，會抑制Wnt的激活［24-25］。但也有研究表明，在小鼠腎上皮細胞中特異性敲除PKD2后，通過增加自分泌Wnt（例如Wnt7a）的產(chǎn)生激活了Wnt/β-catenin信號轉導，導致Wnt信號通路的相關靶基因表達上調［26］。因此，我們推測在不同細胞和組織中PKD2對Wnt信號通路的異常激活有不同的影響，但仍需要進一步驗證。

綜上所述，BMSCs成脂分化過程中PKD2表達增高；PKD2過表達可抑制BMSCs向脂肪細胞分化，并伴隨Wnt通路相關蛋白表達上調。但細胞在不同環(huán)境下，PKD2如何調控Wnt/β-catenin信號通路還有待進一步研究。