沉默CLDN4增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對多西他賽的敏感性

吳 磊，李國慶，趙宏偉

(平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院泌尿外科，河南平頂山 467000)

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性中最常見的惡性腫瘤，也是全世界男性癌癥相關(guān)死亡的第2大主要原因[1]。多西他賽是治療PC的標(biāo)準(zhǔn)一線化療藥物，并且在轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性PC(metastatic castration resistant PC，mCRPC)中具有生存優(yōu)勢，但經(jīng)過長時間的治療會出現(xiàn)耐藥性[2-3]。多西他賽抵抗已經(jīng)成為臨床急需解決的問題之一，約50%的患者對多西他賽的反應(yīng)較差及最初反應(yīng)良好而最終產(chǎn)生抗性表型[4-5]。CLDN4是上皮緊密連接的主要組成部分，在上皮性惡性腫瘤中表達(dá)增加[6-8]。最近有研究顯示，降低CLDN4的表達(dá)可提高乳腺癌和胰腺導(dǎo)管癌對化療的敏感性[9-10]。多項(xiàng)研究顯示，PI3K/AKT信號通路傳導(dǎo)與腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)[11-13]。目前尚不清楚CLDN4是否參與前列腺癌細(xì)胞對多西他賽的耐藥，是否可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo)影響前列腺癌細(xì)胞對多西他賽的敏感性。因此本文選用PC細(xì)胞系，采用轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低PC細(xì)胞中CLDN4的表達(dá)，檢測CLDN4對PC細(xì)胞增殖、凋亡和對多西他賽敏感性的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料前列腺癌細(xì)胞DU145、PC3、LNCaP購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，ALVA41和人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1由其他實(shí)驗(yàn)室贈送。RPMI 1640培養(yǎng)基、MTT粉末等購于北京鼎國有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；陰性對照質(zhì)粒(si-NC)、miR-141干擾質(zhì)粒(siRNA1和siRNA2)由北京華大基因合成；多西他賽購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；anti-CLDN4、anti-PI3K、anti-p-PI3K、anti-AKT、anti-p-AKT、anti-Bax、anti-Bcl-2抗體均購于abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒、凋亡檢測試劑盒購于碧云天有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1qRT-PCR實(shí)驗(yàn)根據(jù)試劑盒說明書提取細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時定量PCR。以管家基因U6的mRNA水平作為內(nèi)參照。引物設(shè)計如下：CLDN4上游引物序列5′-CACATCCACCTCCTCCACATC-3′，下游引物序列5′-AATGCGGCCGCAACT CAATCAA CATCACCAT-3′，U6上游引物序列5′-AGAAGGCTGGGG CTCATTTG-3′，下游引物序列5′-AGGGGCCATCCACAG TCTTC-3′，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.2Westernblot實(shí)驗(yàn)提取不同處理組細(xì)胞的總蛋白，定取30μg的蛋白量，并配置5 %的濃縮膠和15 %的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用1% BSA室溫封閉2 h、經(jīng)過一抗孵育(1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜)、TBST洗滌3次、二抗孵育(1∶4 000稀釋，室溫孵育1 h)、TBST洗滌3次后，在膜上滴加適量化學(xué)發(fā)光顯色液并置于Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.2.3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)LNCaP細(xì)胞以104個/孔的密度接種于6孔中，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞匯合度約為70%時，將對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染si-NC)、siRNA1組和siRNA2組，按照脂質(zhì)體lipofeetamine 2000說明書步驟操作，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以每孔2×103的密度接種于96孔板中，同時設(shè)置對照組和空白對照組，培養(yǎng)24 h后給予不同處理，至檢測時間點(diǎn)時，在每孔中加入20 μL MTT溶液，放置恒溫箱中繼續(xù)孵育4 h。然后去除上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，震蕩5 min使細(xì)胞充分裂解，然后用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的吸光度值(A)，存活率=[1-(A處理組-A空白對照組/A對照組-A空白對照組)]×100%。

1.2.5V-FITC聯(lián)合PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率細(xì)胞以每孔3×105個的密度接種至6孔板中，于恒溫箱中孵育48 h之后收集細(xì)胞，用PBS洗滌2～3遍。然后每管加入500 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μl的碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀檢測。流式凋亡圖左上象限(Q1)表示壞死的細(xì)胞，右上象限(Q2)表示晚期凋亡細(xì)胞，左下象限(Q3)表示正常的細(xì)胞，右下象限(Q4)表示早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 CLDN4在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)4種前列腺癌細(xì)胞中CLDN4 mRNA相對表達(dá)水平均高于人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1(P<0.01，圖1A)。4種前列腺癌細(xì)胞中CLDN4蛋白表達(dá)水平均高于人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1(P<0.05)，且LNCaP細(xì)胞中CLDN4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平最高，選擇LNCaP細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)(圖1B、C)。

2.2 轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低LNCaP細(xì)胞中CLDN4蛋白的表達(dá)水平對照組和陰性對照組間CLDN4蛋白表達(dá)水平無差異，siRNA1和siRNA2組CLDN4蛋白表達(dá)水平均低對照組和陰性對照組(P<0.001)，siRNA1組CLDN4蛋白表達(dá)水平雖低于siRNA2組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)，選用siRNA1組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 不同處理組對LNCaP細(xì)胞增殖的影響多西他賽呈劑量依賴性抑制LNCaP細(xì)胞的增殖，IC50=25.4 μg/mL，95%CI:21.6～29.9 μg/mL，選擇接近IC50值的濃度20 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖3A)。細(xì)胞培養(yǎng)72 h時，siRNA1+多西他賽組和siRNA2+多西他賽組細(xì)胞存活率分別為(45.8±4.6)%和(44.2±3.6)%，低于siRNA1組[(67.9±4.3)%]、siRNA2組[(68.5±4.6)%]、多西他賽組[(62.4±2.9)%]和對照組[(97.5±1.9)%]，P<0.05(圖3B)。

A:CLDN4 mRNA相對表達(dá)水平(與RWPE-1組相比，**P<0.01，***P<0.001)；B:CLDN4蛋白表達(dá)情況；C:CLDN4蛋白灰度值分析(與RWPE-1組相比，*P<0.05，***P<0.001)。

A：電泳圖；B：柱狀圖。圖2 經(jīng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒處理后不同組間CLDN4蛋白表達(dá)情況(與對照組相比，***P<0.001)

A：多西他賽抑制LNCaP細(xì)胞增殖；B：不同處理組對LNCaP細(xì)胞增殖抑制作用圖3 不同處理組對LNCaP細(xì)胞增殖的影響

2.4 不同處理組對LNCaP細(xì)胞凋亡的影響siRNA1組和siRNA2組細(xì)胞凋亡率分別為(35.5±5.4)%和(34.6±4.7)%，多西他賽細(xì)胞凋亡率為(37.3±4.7)%，均高于對照組[(5.3±1.2)%](P<0.001，圖4)。siRNA1+多西他賽組和siRNA2+多西他賽組細(xì)胞凋亡率分別為(62.1±6.3)%和(60.2±5.8)%，高于siRNA1組、多西他賽組和對照組(P<0.001，圖4)。

2.5 不同處理組對PI3K/AKT信號通路中的關(guān)鍵蛋白和凋亡蛋白的影響siRNA1組、多西他賽組和siRNA1組+多西他賽組中CLDN4、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均低于對照組，Bax蛋白表達(dá)水平高于對照組(P<0.05，圖5)。siRNA1組+多西他賽組CLDN4、p-PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均低于siRNA1組和多西他賽組，Bax蛋白表達(dá)水平高于siRNA1組和多西他賽組(P<0.05，圖5)。

A：流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況；B：各組細(xì)胞凋亡率的比較(*與對照組比較P<0.001)。

A:不同處理組蛋白表達(dá)；B：不同處理組間蛋白灰度值分析。*與對照組比較，P<0.05；#與siRNA1和多西他賽比較，P<0.05。

3 討 論

在緊密結(jié)合的分子中，CLDN4是主要的跨膜蛋白，由24個基因家族組成。緊密連接是哺乳動物上皮細(xì)胞中細(xì)胞間連接復(fù)合物的最頂端成分，它們充當(dāng)離子和溶質(zhì)運(yùn)輸?shù)陌胪钙琳?，為分隔質(zhì)膜頂端和基底外側(cè)結(jié)構(gòu)域的柵欄。此外，緊密連接分子可協(xié)調(diào)各種信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和極性，為一種多功能復(fù)合物。在惡性細(xì)胞中常觀察到緊密連接分子的破壞和細(xì)胞極性的喪失[14-16]。另外緊密連接分子被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。CLDNs特別是CLDN3和/或CLDN4的在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中過表達(dá)[17-19]。在本研究中，從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測到前列腺癌細(xì)胞中CLDN4的表達(dá)水平處于過表達(dá)狀態(tài)。多西他賽為多種腫瘤的一線化療藥物，最近一項(xiàng)研究顯示，CLDN4的表達(dá)下調(diào)且可影響胃癌對多西他賽的敏感性[20]。GAO等[21]研究顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素C端的特異性受體可能通過調(diào)節(jié)CLDN4水平，破壞細(xì)胞間緊密連接的屏障并增強(qiáng)細(xì)胞吸收能力，從而提高乳腺癌細(xì)胞對順鉑和紫杉醇的敏感性。

本研究中，LNCaP細(xì)胞中CLDN4的表達(dá)水平最高，多西他賽對其增殖抑制呈劑量依賴性，選擇20 μg/L的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA1和siRNA2組細(xì)胞的存活率低于對照組，與多西他賽聯(lián)合后對細(xì)胞的增殖作用增強(qiáng)，說明在前列腺癌細(xì)胞中CLDN4的水平下調(diào)可增加細(xì)胞對多西他賽的敏感性。在凋亡實(shí)驗(yàn)中檢測到，siRNA1+多西他賽組及siRNA2+多西他賽組細(xì)胞的凋亡率高于siRNA1組、siRNA2和多西他賽組，更進(jìn)一步說明CLDN4的表達(dá)下調(diào)可增加前列腺癌細(xì)胞對多西他賽的敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在許多腫瘤中存在PI3K/AKT信號通路的異常，該通路中關(guān)鍵蛋白的改變可導(dǎo)致通路功能改變，從而引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，不僅可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，還與腫瘤耐藥密切相關(guān)[22]。在本文中作者檢測到siRNA1、多西他賽組和siRNA1聯(lián)合多西他賽組與對照組相比均顯著抑制PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo)，且siRNA1聯(lián)合多西他賽組對PI3K/AKT信號通路抑制作用最強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著增加，抑制細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)水平顯著降低。多西他賽單獨(dú)作用于LNCaP細(xì)胞時，可抑制CLDN4蛋白的表達(dá)，多西他賽是通過其他途徑抑制CLDN4蛋白的表達(dá)還是直接靶向CLDN4蛋白的表達(dá)，將是作者后續(xù)的研究方向，為多西他賽的抗腫瘤活性作用機(jī)制和耐藥機(jī)制做進(jìn)一步的研究。

綜上所述，CLDN4在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，降低其表達(dá)水平后，通過抑制PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)細(xì)胞對多西他賽的敏感性。