大鼠急性低氧運動對心肌細胞瞬時外向鉀電流的影響

馬山山，李佳鑫，陳雅婷，蔡鐘奇，白婧，劉傳斌，李泱*，曹雪濱

(1承德醫(yī)學院研究生院，河北 承德 067000；2解放軍陸軍第八十二集團軍醫(yī)院心腎內科，河北 保定 071000；3河北大學中醫(yī)學院，河北 保定 071000；4解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心心血管病醫(yī)學部研究所，北京100048)

隨著高原地區(qū)經(jīng)濟和旅游業(yè)突飛猛進的發(fā)展，越來越多的平原人前往高原地區(qū)。西部高原也是我國國防的重中之重，而平原地區(qū)部隊急進高原，尤其是在急進高原后進行強體力作業(yè)(搶險救災、軍訓軍演、爬山負重等)將引起機體尤其是心臟功能的損傷[1]。高原低氧環(huán)境對心臟功能的損傷導致心律失常事件增加已被廣泛認知[2，3]。急性運動后心率變異性增高，機體氧化應激水平明顯升高，導致心功能降低，心律失常時間增加[4]。但急進高原低氧與強體力作業(yè)復合應激刺激對心臟功能的影響研究較少，相關機制尚不清楚。

眾所周知，心律失常的基礎是心肌細胞電生理改變，急性缺氧和力竭運動均可改變心臟電生理，誘發(fā)心律失常[5，6]。瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)是心肌細胞復極化電流的一個重要成分，它主要參與了動作電位復極化的1 期和2期，其改變可引起復極異常，誘發(fā)心律失常[7]。雖然已有低氧狀態(tài)下Ito電流改變的研究，但目前尚未發(fā)現(xiàn)力竭運動是否也影響Ito，尤其是急性低氧和力竭運動復合應激源刺激對Ito電流影響尚未見報道。本研究利用低壓氧艙聯(lián)合轉輪力竭運動制備大鼠應激模型，利用膜片鉗技術記錄單個心房肌細胞Ito的變化，進一步探討其電流變化的門控機制，探究急進高原后進行強體力作業(yè)誘發(fā)心律失常的可能細胞電生理機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與溶液

膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、天門冬氨酸鉀、丙酮酸鈉、三磷酸腺苷鎂(magnesium adenosine triphosphate，MgATP)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonic acid，HEPEs]、CaCl2、CdCl2、BaCl2、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)、河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)、乙二醇醚二胺四乙酸(ethylene glycol ether diamine tetraacetic acid，EGTA)、多非利特均為美國希格瑪公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

臺氏液(Tyrode′s solution，Tyrode′s 液)的組成成份：NaCl 135.00 mmol/L，KCl 5.40 mmol/L，CaCl21.80 mmol/L，MgCl21.00 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，HEPEs 10.00 mmol/L，葡萄糖10.00 mmol/L，pH值用NaOH調至7.3；無鈣Tyrode液和0.20 mmol/L Ca2+Tyrode液，分別為Tyrode液中不加CaCl2和加0.20 mmol/L CaCl2。

記錄Ito電流的細胞外液：NaCl 140.0 mmol/L，MgCl25.0 mmol/L，CaCl20.5 mmol/L，HEPEs 5.0 mmol/L，CdCl20.1 mmol/L，用NaOH調pH值至7.2。

記錄Ito電流的細胞內液：KCl 45 mmol/L，門冬氨酸鉀(K-aspartate)85 mmol/L，天冬氨酸鈉(Na-pytuvate)5 mmol/L，MgATP 5 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPEs 10 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，用KOH調pH值至7.4。

細胞保護液(KB solution，KB液)：KOH 110 mmol/L，?；撬?0 mmol/L，草酸10 mmol/L，谷氨酸70 mmol/L，KCl 25 mmol/L，KH3PO410 mmol/L，EGTA 5 mmol/L， HEPEs 5 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，用KOH調至pH 7.4。

1.2 儀器

動物實驗氧艙(中國煙臺冰輪高氧艙有限公司，10-UWC800-02)、真空壓力表(中國青島工業(yè)儀表研究所，MC02000113)、數(shù)字智能測氧儀(中國北京航天鵬程儀器儀表有限公司，ML-I)、膜片鉗放大器(美國分子儀器公司，Axon-700B)。刺激信號及電壓輸入信號的采集應用數(shù)模轉換器(美國分子儀器公司，Digidata 1440A)，處理軟件(美國分子儀器公司，pCLAMP10.4)。微電極拉制儀(日本成茂公司，pp-83)。

1.3 建立大鼠低氧運動模型

健康雄性清潔級SD大鼠40只，購買自解放軍總醫(yī)院動物中心，體質量(160±15)g，實驗室環(huán)境下喂養(yǎng)7 d，使大鼠熟悉環(huán)境。將大鼠隨機分為以下4組，每組10只：低氧運動組(hypoxic exercise，HO-E)、低氧安靜組(hypoxic quiescent，HO-Q)、常氧運動組(normal oxygen exercise，NO-E)、常氧安靜組(normal oxygen quiescent，NO-Q)。參照文獻進行低壓氧艙/跑輪運動模擬試驗[8，9]，選擇2組低壓氧艙的大鼠，單只置于飼養(yǎng)籠或力竭運動跑輪中，分別放入低壓氧艙內，關閉低壓氧艙艙門，打開負壓泵與負壓閥，控制降壓速度，使低壓氧艙氧分壓在25 min左右降低至61.6 kPa。其中HO-E組跑輪運動時間設定：總時間為4 h，每運行25 min停轉5 min，運行速度為18 m/min，正轉倒轉交替進行，試驗結束時打開泄壓閥，在25 min左右升壓至大氣壓；HO-Q組：在上述低氧條件下飼養(yǎng)4 h。待低壓氧艙內氣壓穩(wěn)定至大氣壓后，開啟艙門取出跑輪和飼養(yǎng)籠。

選擇2組常氧的大鼠，單只置于飼養(yǎng)籠或力竭運動跑輪中，依照低氧組設定條件進行實驗。

1.4 大鼠單個心室肌細胞分離

參照文獻采用酶解法制備心室肌單細胞[10]。上述各組大鼠經(jīng)腹腔20%水合氯醛(2 ml/kg)麻醉，迅速取心臟，在37℃和通氧條件下行離體哺乳動物心臟灌流(Langendorff法)。用無Ca2+Tyrode′s 液灌流3～5 min，用含Ⅱ型膠原酶50 mg、胰蛋白酶8 mg無Ca2+Tyrode′s 液灌流(30 ml)15～20 min。沿房室間溝取心室肌，剪碎入KB液中并吹打使細胞脫落，并于2℃～8℃保存，1.0 h后進行實驗。取保存液加于1.0 ml灌流槽中，待細胞貼壁后，于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無顆粒、橫紋清晰、無收縮的細胞，室溫下進行實驗。

1.5 干擾電流的排除

于細胞外液加入多非利特5 nmol/L阻斷IKr，CdCl2100 μmol/L阻斷ICa-L，TTX 100 μmol/L阻斷INa。

1.6 膜片鉗全細胞記錄

采用全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制下記錄電流。將膜片鉗放大器同計算機連接。刺激信號及電壓輸入信號的采集應用數(shù)模轉換器，均由軟件控制。GG-17玻璃毛坯經(jīng)pp-83微電極拉制儀拉制成電阻為2.0～5.5 MΩ的電極。調節(jié)三維操縱器進行封接，使封接電阻達1 GΩ 以上，吸破細胞膜形成全細胞記錄模式。測定電容時，施以0.4 V/s的斜坡刺激，測電流并按方程Cm=I/(dV/dt)計算(Cm為膜電容，I為電流值，dV/dt即電壓斜率)。為消除細胞間的誤差，I值以電流密度(pA/pF)表示。信號經(jīng)截止頻率為1 kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣率為5 kHz。串聯(lián)電阻補償90%～95%以消除電壓偏差，液接電位補償校正至小于2 mV，慢電容補償約為85%～90%，以消除膜電容的充放電影響。

1.7 電流參數(shù)的設定[11]

Ito的峰值電流測定：在電壓鉗方式下，保持電位-80 mV，先給予-40 mV，20 ms的預刺激失活鈉電流，施予+40 mV，300 ms的去極化脈沖，可記錄到快速激活的外向電流，該電流被2 mmol/L的4-AP阻斷，即為Ito。

Ito電流-電壓曲線的繪制：在電壓鉗方式下，保持電位-80 mV，先給予-40 mV，20 ms預刺激失活鈉電流，再施予300 ms，階躍10 mV，-40 mV～+50 mV的系列去極化脈沖，求算電流密度。以各電壓下的電流密度與測試電壓作圖，得電流-電壓曲線。

Ito穩(wěn)態(tài)激活曲線的繪制：保持電位-80 mV，先給予-40 mV，20 ms的預刺激失活鈉電流，再施予500 ms，階躍為10 mV，-80 mV～+40 mV的系列去極化脈沖，可記錄到Ito電流，標準化各電流幅值，以相對電流對各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)激活曲線，并用Boltzmann方程I/Imax=1/{1 + exp[(Vm-V1/2)/k]}進行曲線擬合求出半激活電壓(V1/2)和激活曲線斜率(k)。

Ito穩(wěn)態(tài)失活曲線的繪制：保持電位-80 mV，施予1000 ms，階躍為10 mV，-90 mV～+20 mV的系列去極化脈沖在每一條件脈沖后緊跟一固定去極化至+40 mV，300 ms的測試脈沖，記錄Ito，標準化各電流幅值，以相對電流對各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)失活曲線，并用Boltzmann方程I/Imax=1/{1+exp[-(Vm-V1/2)/k]}進行曲線擬合求出半失活電壓(V1/2)和失活曲線斜率(k)。

Ito關閉態(tài)失活時間常數(shù)：鉗制電位-110 mV，給予+40 mV，300 ms的條件刺激，回復至-110 mV，再給予-65 mV，5、10、25、50、100、200、400、800 ms不同時間使通道失活，在每個時間間隔后緊接著一個+40 mV，300 ms的測試刺激，此過程用單項指數(shù)式擬合。

Ito失活后恢復曲線的繪制：鉗制電位-80 mV，給予+40 mV，300 ms的去極化脈沖，分別間隔40、80、160、320、640、1280、2560和5120 ms后，再施予第2次+40 mV，300 ms的方波刺激，將第2次方波脈沖引出的電流與條件刺激電流相比，按單項指數(shù)式：I=A×Exp(-t/τ)，求出恢復曲線的值。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito電流密度的影響

在+40 mV時，NO-Q組、HO-Q組、NO-E組和HO-E組電流密度分別為 (28.2±3.2)、(17.6±1.9)、(14.5±2.1)和(9.8±1.1)pA/pF。HO-Q組、NO-E組、HO-E組與NO-Q組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與常NO-Q組相比，NO-E組大鼠心室肌細胞的Ito電流密度明顯降低，說明急性低氧運動可明顯降低Ito電流密度，且較單獨急性低氧或力竭運動的效應更加明顯(圖1)。

圖1 急性低氧運動對Ito電流幅值及電流密度的影響Figure 1 Effect of acute hypoxic exercise on Ito current amplitude and current density A: influence of acute hypoxic exercise on current amplitude; B: effect of acute hypoxic exercise on peak current density. Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise. Compared with NO-Q group, *P<0.05, ** P<0.01.

2.2 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito作用的電壓依賴性

大鼠心肌細胞約在-10 mV 電位刺激時，Ito電流開始被激活，隨著刺激脈沖向去極化移動，電流密度逐漸增加，并呈現(xiàn)出明顯的外向整流特征。低氧運動后，各電壓下電流密度均降低，尤其是在+10 mV以上，隨著刺激電壓的增加電流密度降低更加明顯，提示低氧運動時大鼠心室肌細胞Ito的阻滯效應具有電壓依賴性特征(圖2)。

圖2 急性低氧運動對Ito電流I-V曲線的影響Figure 2 Effect of acute hypoxic exercise on I-V curve of Ito current Ito: transient outward potassium current; I-V: voltage-current curve; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise.

2.3 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito穩(wěn)態(tài)激活的影響

低氧運動后，大鼠心室肌細胞的Ito激活曲線明顯向去極化方向移動，NO-Q組半激活電壓(V1/2，act)為(-36.4±2.4)mV、而HO-Q組、NO-E組和HO-E組分別為(-32.8±3.5)、(-26.0±2.7)和(-17.9±2.1)mV。其中NO-E組、HO-E組與NO-Q組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。低氧運動對通道激活曲線斜率(kact)幾乎無影響(圖3)。進一步，單純低氧應激較單純力竭運動均對通道半激活電壓有影響，但前者小于后者。

2.4 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito穩(wěn)態(tài)失活和關閉態(tài)失活的影響

研究結果顯示，低氧運動使大鼠心肌細胞Ito穩(wěn)態(tài)失活左移，半失活電壓(V1/2inact)數(shù)值增大，且低氧運動使通道的失活曲線斜率(kinact)增加，提示在相同刺激電位下，低氧運動后通道失活增加，有效通道數(shù)減少(圖4)。進一步，單純低氧應激與單純力竭運動對通道半失活電壓的影響相似，而單純低氧應激與單純力竭運動對通道失活斜率電壓的影響要小，且兩者之間存在顯著性差異(P<0.05)，提示單純低氧應激降低Ito電流的門控機制由改變穩(wěn)態(tài)激活及穩(wěn)態(tài)失活電壓所致，而單純力竭運動降低Ito電流的門控機制主要來自穩(wěn)態(tài)失活斜率的改變。

圖3 急性低氧運動對Ito電流穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響Figure 3 Effect of acute hypoxic exercise on steady-state activation curve of Ito current A: acute hypoxic exercise shifts the current steady-state activation curve to the right; B: acute hypoxic exercise shifts the semi-activated voltage to the correct voltage; C: acute hypoxic exercise causes the slope of the current steady-state activation curve to change less. Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise. Compared with NO-Q group, *P<0.05, ** P<0.01.

圖4 急性低氧運動對Ito電流穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響Figure 4 Effect of acute hypoxic exercise on steady-state inactivation curve of Ito current A: acute hypoxic exercise shifts the current steady-state inactivation curve to the left; B: acute hypoxic exercise shifts the half-inactivation voltage to a more negative voltage; C: acute hypoxic exercise increases the slope of the current steady-state inactivation curve. Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise. Compared with NO-Q group, *P<0.05, ** P<0.01.

關閉態(tài)失活動力學結果顯示，低氧運動對關閉態(tài)失活曲線及電流的時間參數(shù)雖有影響，但差異無統(tǒng)計學意義。提示急性低氧運動抑制通道電流的作用與通道關閉態(tài)失活關系不大(圖5)。

2.5 急性低氧運動對大鼠心室肌細胞Ito失活后恢復曲線的影響

大鼠心室肌細胞Ito的失活后恢復在HO-E組顯著減慢，恢復時間常數(shù)(τ)明顯延長，NO-Q組、HO-Q組、NO-E組和HO-E組時間常數(shù)分別為(333.2±25.1)、(382.5±17.8)、(430.2±31.6)和(464.2±29.7)ms，可見低氧聯(lián)合力竭運動后Ito的恢復曲線明顯右移，提示通道失活后恢復過程減慢(圖6)。

圖5 急性低氧運動對Ito電流關閉態(tài)失活動力學的影響Figure 5 Effect of acute hypoxic exercise on inactivation mechanics of Ito current closed state Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise.

圖6 急性低氧運動對Ito電流失活后恢復動力學的影響Figure 6 Effect of acute hypoxic exercise on recovery kinetics after Ito current inactivation A: acute hypoxic exercise makes the recovery curve shift to the right after the current is inactivated; B: acute hypoxic exercise increases the recovery time constant after the current is inactivated. Ito: transient outward potassium current; NO-Q: normal oxygen quiescent; HO-Q: hypoxic quiescent; NO-E: normal oxygen exercise; HO-E: hypoxic exercise. Compared with NO-Q group, *P<0.05.

3 討 論

高原低氧環(huán)境和運動應激均能對心臟功能造成損傷，研究顯示，急進高原人員心臟功能明顯降低，心電圖發(fā)生顯著變化，易誘發(fā)心律失常的發(fā)生[12，13]。但急進高原低氧環(huán)境中運動應激復合刺激影響心肌電生理及心律失常的機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在急性低氧聯(lián)合力竭運動的大鼠模型中，心室肌細胞的Ito降低，而且較單獨低氧或運動的效應更加明顯。Ito電流的大小對動作電位的形態(tài)和時程有較大影響，主要與動作電位的復極1相有關。研究顯示，當心肌應激時，Ito作為復極早期的重要電流，其電流密度降低將誘發(fā)心律失常[14]。本研究結果提示急性低氧運動導致心律失常發(fā)生的機制很可能與其阻滯心室肌細胞細胞膜Ito電流、延長動作電位時程、導致心肌細胞復極異常有關。

通過門控機制研究，我們發(fā)現(xiàn)Ito電流降低主要與急性低氧運動后通道穩(wěn)態(tài)激活和穩(wěn)態(tài)失活過程有關，使相同電位刺激時，通道開放降低，失活增加，從而降低有效通道的數(shù)量，引起Ito電流密度降低。同時，電流降低還與急性低氧運動使通道失活后恢復動力學減緩，恢復時間常數(shù)增加有關，進一步延緩了心肌的動作電位時程[15]。但急性低氧運動對通道關閉態(tài)失活動力學幾乎沒有影響。本研究結果顯示，單純低氧應激與單純力竭運動均可降低Ito密度，但兩者Ito通道的門控機制效應卻不相同，單純低氧應激比單純力竭運動對通道失活斜率電壓的影響更小，提示單純低氧應激降低Ito電流的門控機制由改變穩(wěn)態(tài)激活及穩(wěn)態(tài)失活電壓所致，力竭運動降低Ito電流的門控機制主要來自穩(wěn)態(tài)失活斜率的改變。

本實驗局限性在于未能深入探究調節(jié)Ito通道蛋白的相關基因。我們知道，一個離子通道電流的改變，主要來自兩個方面：(1)通道門控機制的變化，包括通道穩(wěn)態(tài)激活、穩(wěn)態(tài)失活過程、激活與失活動力學及失活后恢復動力學的改變[11]；(2)細胞膜有效通道數(shù)量的變化，可能由于通道基因合成、轉錄、翻譯及翻譯后修飾，尤其是通道蛋白從高爾基體向細胞膜的轉運過程改變[16]，而基因和蛋白的表達，特別是Kv4.2/Kv4.3蛋白在細胞膜的表達，直接影響Ito電流密度的大小，這在今后的工作中需要補充研究。

本研究結果顯示，心肌細胞瞬時外向鉀電流的變化作為影響心肌電生理的基礎，是急性低氧運動導致心律失常的重要機制之一，為相關復合應激刺激引起的心肌損傷和心律失常的機制探討提供理論依據(jù)。