虎榆軟膏治療變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠模型的藥效學(xué)及作用機(jī)制

劉丹，夏筆軍，文思，何皎，葉理，宮燦儀，邱苗芳

1.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091; 2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623

皮炎、濕疹是由遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌、神經(jīng)、感染等多種因素引起的表現(xiàn)為不規(guī)則性丘疹以及糜爛和水皰等的炎癥性皮膚病，包括變應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis,ACD)、濕疹和特應(yīng)性皮炎等。Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)參與其發(fā)病機(jī)制?；⒂苘浉酁楸驹褐苿?，主治亞急性、慢性皮炎濕疹。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其療效，本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠急性、慢性ACD模型，探索該藥對(duì)皮炎、濕疹的治療作用，并從免疫炎癥角度探討其作用機(jī)制，為臨床開展應(yīng)用虎榆軟膏治療皮炎、濕疹提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57小鼠60只，雌性，7～8周齡，體重18～23 g[廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)NO. 44007200027365，許可證號(hào)SCXK (粵) 2013-0002]，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%。

藥物及試劑：虎榆軟膏(批號(hào)20200302)、虎榆軟膏陰性對(duì)照(批號(hào)20200302)、氫化可的松乳膏(批號(hào)20200228)，均由我院制劑室配制。2、4-二硝基氟苯(DNFB，阿拉丁，批號(hào)L1705138)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，批號(hào)AJ60795A)；qPCR試劑盒(TaKaRa，批號(hào)AJ61478A)，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL- 4、IL-17引物(北京六合華大基因科技有限公司)。

儀器：高速冷凍離心機(jī)(5424R，Eppendorf)，旋渦振蕩儀(VORTEX-5，Qilinberier)，千分尺(精密度0.001 mm，三量量具)，光學(xué)顯微鏡(CX31，OLYMPUS)，電子天平(MS-105，瑞士梅特勒)，打耳器(YLS-Q4，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)，小動(dòng)物麻醉機(jī)(德國CK)，微量分光光度計(jì)(NANODROP ONE，Thermo scientific)，多功能皮膚屏障檢測(cè)儀(MPA580，德國Courage and Khazaka公司)，RT-PCR儀(CFX Connect Real-time System，BIO-RAD)，熒光定量PCR儀(T100 Thermal Cycler，BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 急性、慢性ACD模型的建立與給藥 將60只C57小鼠分為急性、慢性各5組，每組6只。分別為空白對(duì)照組、模型組、虎榆軟膏組、陽性組、基質(zhì)組。按參考文獻(xiàn)[1-4]建立模型及給藥。急性模型：5組實(shí)驗(yàn)前1 d每只小鼠下腹部剃毛3 cm×3 cm范圍，第1 d于該脫毛部位涂50 μL 0.5% DNFB丙酮橄欖油溶液(4 ∶1)致敏，空白對(duì)照組涂空白溶劑， 5 d后每只小鼠右耳內(nèi)外側(cè)各均勻涂10 μL 0.2% DNFB溶液進(jìn)行激發(fā)，空白對(duì)照組涂空白溶劑，每天1次，連續(xù)激發(fā)兩次。1 d后右耳開始給藥，基質(zhì)組給予空白基質(zhì)，虎榆軟膏組給予虎榆軟膏，陽性組給予氫化可的松乳膏，一天2次。

慢性模型：5組實(shí)驗(yàn)前1 d每只小鼠下腹部、背部剃毛3 cm×3 cm范圍，第1 d于下腹部脫毛部位涂50 μL 0.5% DNFB丙酮橄欖油溶液(4 ∶1)致敏，5 d后50 μL 0.2% DNFB激發(fā)背部，每隔1 d激發(fā)1次，共激發(fā)14次，空白對(duì)照組涂空白溶劑。每次激發(fā)后2 h給藥，空白對(duì)照組、模型組不給藥，基質(zhì)組給予空白基質(zhì)，虎榆軟膏組給予虎榆軟膏，陽性組給予氫化可的松乳膏，一天2次。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo) HE與甲苯胺藍(lán)染色：急性ACD模型小鼠耳部、慢性ACD模型小鼠背部皮膚組織標(biāo)本置于固定液中，經(jīng)石蠟包埋固定，制成5 μm 的薄層切片，HE、甲苯胺藍(lán)染色。在高倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚組織病理學(xué)改變。皮膚屏障功能檢測(cè)：慢性ACD模型小鼠末次激發(fā)24 h后，置小動(dòng)物麻醉機(jī)中麻醉，多功能皮膚屏障檢測(cè)儀測(cè)量背部皮膚角質(zhì)層水合力(stratum corneum hydration,SCH)、透皮失水量(transdermal water loss,TEWL)、pH值。

耳厚度和耳重量差:急性ACD模型小鼠在激發(fā)前、末次激發(fā)24 h，千分尺分別測(cè)量小鼠耳厚度，計(jì)算耳腫脹度；處死小鼠，打耳器打下左右耳，十萬分之一天平稱量左右耳質(zhì)量，計(jì)算左右耳質(zhì)量差。

臟器指數(shù)：慢性ACD模型小鼠末次激發(fā)48 h后，稱量小鼠體重，處死小鼠，取脾臟稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。

TNF-α、IL-1β、IL-6、IL- 4、IL-17 mRNA表達(dá)量檢測(cè)：取慢性ACD模型小鼠背部皮膚置于triozol中，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qPCR檢測(cè)，引物序列如下:TNF-α F:5′-TCAGTTCCATGGCCCAGAC-3′,R:5′-GTTGTCTTTGAG-ATCCATGCCT-3′;IL-1β F:5′-GCAACTGTTCCTGAACTCA-ACT-3′,R:5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′;IL-6 F:5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′,R:5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′;IL- 4 F:5′-AC-AGGAGAAGGGACGCCAT-3′,R:5′-GAAGCCCTACAGACGAGCTCA-3′;IL-17 F:5′-TCGCCATTCAGCAAGAAATCC-3′,R:5′-CACAGGTGCAGCCAAC-TTTTA-3′;GAPDH F:5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′,R:5′-AGATCCACAA-CGGATACATT-3′。Real-time PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：94 ℃ 60 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組間耳腫脹度、耳重量差、SCH等比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 虎榆軟膏對(duì)急性ACD模型小鼠耳病理學(xué)改變的影響

從HE染色看，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠耳表皮角化過度、增厚，海綿水腫，血管擴(kuò)張，充血明顯，真皮以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主，可見淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞,表明急性ACD造模成功；與模型組相比，虎榆軟膏組和陽性藥物組表皮增厚程度減小，水腫減輕，單核細(xì)胞浸潤(rùn)減少，真皮血管擴(kuò)張充血現(xiàn)象緩解，基質(zhì)組未見緩解。從甲苯胺藍(lán)染色看，模型組和基質(zhì)組小鼠肥大細(xì)胞數(shù)量多于空白對(duì)照組，虎榆軟膏組肥大細(xì)胞數(shù)量少于模型組，見圖1。

圖1 急性ACD小鼠及耳組織病理圖片(200×)Fig. 1 Acute ACD mice and histopathological images of ears (200×).

2.2 虎榆軟膏對(duì)急性ACD模型小鼠耳腫脹和耳重量差的影響

模型組末次激發(fā)后24 h耳腫脹較空白對(duì)照組明顯升高 (t=25.33,P<0.01)，左右耳質(zhì)量差增大(t=8.23,P<0.01)，表明急性ACD造模成功。與模型組相比較：虎榆軟膏組、陽性組、基質(zhì)組耳腫脹度均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為16.46、20.00、6.202，P值均<0.01)；虎榆軟膏組、陽性組左右耳質(zhì)量差均明顯減小(t值分別為4.62、5.71，P值均<0.01)，基質(zhì)組左右耳質(zhì)量差增大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.19，P=0.060)。表明虎榆軟膏對(duì)急性ACD有明顯作用，詳見表1。

表1 虎榆軟膏對(duì)急性ACD模型小鼠的影響Tab.1 Effects of Huyu ointment on acute

2.3 虎榆軟膏對(duì)慢性ACD模型小鼠皮損及皮膚病理學(xué)改變的影響

相對(duì)于空白對(duì)照組，模型組小鼠背部皮膚增厚、水腫、紅斑，表明慢性ACD模型小鼠造模成功，虎榆軟膏組和陽性組小鼠皮膚增厚、水腫、紅斑狀況均改善。從HE染色看，與空白對(duì)照組相比，模型組和基質(zhì)組小鼠背部表皮增厚，海綿水腫，血管擴(kuò)張，炎性細(xì)胞增多；虎榆軟膏組和陽性藥物組表皮增厚程度減小，水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，真皮血管擴(kuò)張現(xiàn)象緩解。從甲苯胺藍(lán)染色看，模型組和基質(zhì)組小鼠肥大細(xì)胞數(shù)量多于空白對(duì)照組，虎榆軟膏組肥大細(xì)胞數(shù)量少于模型組，見圖2。

圖2 慢性ACD小鼠及背部皮膚組織病理圖片(200×)Fig. 2 Chronic ACD mice and histopathological images of back slin (200×).

2.4 虎榆軟膏對(duì)慢性ACD模型小鼠皮膚屏障功能的影響

SCH：與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠明顯下降(t=13.77,P<0.05)；與模型組比較，虎榆軟膏組明顯升高(t=7.78,P<0.05)。TEWL：與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠明顯升高(t=9.21,P=0.001)；與模型組比較，虎榆軟膏組明顯降低(t=3.12,P=0.014)。pH值：各組小鼠皮膚pH值無明顯差異(P值均>0.05)，見表2。

2.5 虎榆軟膏對(duì)慢性ACD模型小鼠脾臟指數(shù)的影響

與模型組比較，空白對(duì)照組、虎榆軟膏組和陽性組脾臟指數(shù)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為5.22、3.18、6.05，P值均<0.05)，基質(zhì)組無明顯變化(t=1.81,P=0.109)詳見表2。

表2 小鼠皮膚屏障功能指標(biāo)及脾臟指數(shù)Tab.2 Indexes of skin barrier function and spleen index in

2.6 慢性ACD模型小鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL- 4、IL-17 mRNA的表達(dá)

相對(duì)于模型組，虎榆軟膏組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL- 4、IL-17 mRNA表達(dá)量明顯降低(t值分別為3.39、2.16、15.53、20.24、2.82，P值均<0.05)，表明虎榆軟膏能抑制慢性ACD模型小鼠炎癥因子的分泌，詳見表3。

表3 不同組別細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量Tab.3 mRNA expression of cytokine in different

3 討論

DNFB誘導(dǎo)下的小鼠ACD模型是研究變應(yīng)性接觸性皮炎的經(jīng)典模型[5]，已有數(shù)十年的歷史。本研究中，HE染色后觀察急性ACD模型小鼠耳部、慢性ACD模型小鼠背部皮損組織的病變程度，發(fā)現(xiàn)模型組表皮增厚，海綿水腫，血管擴(kuò)張，充血，炎性細(xì)胞增多，與空白對(duì)照組比較差異明顯，說明本實(shí)驗(yàn)造模成功。

皮炎、濕疹病程長(zhǎng)，難治易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前臨床上用于治療皮炎、濕疹的激素類藥存在各種副作用，因此尋找安全有效的藥物具有重要臨床意義。中藥外治皮炎、濕疹以清熱解毒為主，虎榆軟膏由虎杖、地榆、苦參、冰片組成，諸藥合用，共奏清熱解毒、燥濕止癢，斂瘡生肌之功?；⒄葹榫?，有多種藥理作用，包括抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等作用[6-7]，主要成分白黎蘆醇有抗炎及免疫活性[8-10]。地榆收斂止血，可有效減輕創(chuàng)面液體滲出，是一種無毒抗炎活性很強(qiáng)的中藥[11-13]。苦參清熱燥濕，殺蟲、利尿，抗感染抗炎，苦參制劑也被廣泛用于皮膚科[14-16]。冰片涼血清熱止痛，防腐止癢，為佐使?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冰片具有抗細(xì)菌、真菌、消炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[17]。各單味藥的抗炎作用為虎榆組方藥理機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，虎榆軟膏對(duì)急性、慢性ACD小鼠模型均有較好的療效。慢性ACD模型在持續(xù)4周的用藥過程中未發(fā)現(xiàn)藥物的不良反應(yīng)，證明外用虎榆軟膏安全有效。皮膚屏障功能和皮膚組織中炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，外用虎榆軟膏能修復(fù)皮膚屏障，降低皮膚中炎癥因子表達(dá)量，其作用機(jī)制可能與修復(fù)皮膚屏障，調(diào)控Th1、Th2免疫應(yīng)答，降低炎癥因子有關(guān)。提示虎榆軟膏可開發(fā)成為一種較好的治療皮炎、濕疹的非激素外用藥。