慢性光損傷皮膚細胞中可調(diào)控cathepsin D的LncRNAs篩查及靶向位點結(jié)合研究

徐維春, 侯文意, 賴維, 鄭躍

1.中山大學附屬第三醫(yī)院粵東醫(yī)院,廣東 梅州 514700；2.中山大學附屬第三醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510620

皮膚光老化(慢性光損傷)是由于長期暴露于紫外線輻射所引起的皮膚損害，不僅影響容貌，還可造成皮膚完整性及免疫系統(tǒng)的損害，引發(fā)光線性肉芽腫等多種光相關疾病，甚至可導致基底細胞癌、鱗狀細胞癌和惡性黑素瘤等皮膚腫瘤[1]，但具體機制目前未明。有研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶D(cathepsin D)在慢性光損傷皮膚中的表達減少[2]，cathepsin D凝膠可以增加角質(zhì)層中組織蛋白酶D的含量，修復重復光損傷皮膚的表皮屏障[3]，但在皮膚慢性光損傷過程中，cathepsin D上游非編碼RNA(non-coding RNA， ncRNA)調(diào)控機制，以及如何能更穩(wěn)定、高效、特異地調(diào)控cathepsin D來防止皮膚慢性光損傷的發(fā)生，目前仍不清楚。本研究篩查慢性光損傷皮膚細胞中對cathepsin D具有調(diào)控作用的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNAs)，并探討其在皮膚光老化機制中的作用，為進一步揭示皮膚光老化中非編碼RNA的網(wǎng)絡作用機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 皮膚成纖維細胞 來自中山大學附屬第三醫(yī)院泌尿外科3例兒童(5～7歲)包皮環(huán)切術后包皮組織。本研究通過中山大學附屬第三醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批準號[2016]2- 44)，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青-鏈霉素(美國Gibco公司)，細胞衰老半乳糖苷酶(SA-β-Gal)試劑盒(美國Cell signaling technology公司)，細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司),RNA檢測試劑盒(美國Agilent Technologies公司)，核酸純化試劑盒(北京艾德科技有限公司)，二代測序 RNA 文庫制備試劑盒(美國Beckman Coulter公司)。UVA紫外線照射儀(Sigma SS-03A，燈管為Philips UVATLl0RS，波長320～400 nm)、UVA照射計(上海希格瑪高科技有限公司)，NanoPhotometer?分光光度計(美國IMPLEN公司)，熒光定量儀 Qubit?3.0 Flurometer。

1.2 方法

1.2.1 原代皮膚成纖維細胞培養(yǎng) 取兒童包皮，參照文獻[4]分離培養(yǎng)皮膚成纖維細胞，培養(yǎng)至第3代凍存，取細胞復蘇后10代以內(nèi)的細胞行后續(xù)實驗。

1.2.2 建立皮膚成纖維細胞慢性光損傷模型 細胞分為UVA照射組(連續(xù))和空白對照組(不照射),將3～6代成纖維細胞按1×106/皿接種于直徑6 cm的細胞培養(yǎng)皿，待細胞長到70%融合時，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次后，加2 mL PBS。參照文獻[4-6]，將UVA照射組細胞置于UVA輻照儀下，細胞距離光源15 cm，平均照射功率為12.7 mW/cm2，設置單次照射時間為780 s，照射劑量為9.9 J/cm2，照射結(jié)束后PBS洗滌1次，加入2 mL的DMEM培養(yǎng)基，每24 h照射1次，連續(xù)照射14 d。空白對照組細胞加入PBS后置于超凈臺避光，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色檢測細胞老化率 末次UVA照射后48 h去除DMEM培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，按照試劑盒說明書檢測細胞老化。顯微鏡下觀察結(jié)果，老化細胞胞質(zhì)被染成藍色，每皿至少計數(shù)500個細胞，計算陽性細胞所占百分比。實驗重復3次，取均值。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 末次UVA照射后，用胰蛋白酶消化細胞，調(diào)整細胞為1×106/mL。每組取1 mL細胞，預冷PBS洗滌3次后細胞重懸于200 μL結(jié)合緩沖液。加入10 μL膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素及10 μL碘化丙錠，4 ℃反應30 min。加入300 μL結(jié)合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)。實驗重復3次，取均值。

1.2.5 表達基因譜建庫 對UVA照射組和空白對照組細胞，分別使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將全部基因完整轉(zhuǎn)錄為總RNA，使用分光光度計檢測樣品的純度和粗濃度，隨后熒光定量檢測RNA樣品準確濃度，RNA檢測試劑盒檢測RNA樣品完整性。上述檢測合格后，對照組及UVA照射組使用DNase Ⅰ處理，去除rRNA以富集mRNA和non-coding RNA，富集的mRNA和non-coding RNA隨機打斷成短片段(200～500 bp), 以打斷后的短片段為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，在合成cDNA第二鏈時，用dUTP替代dTTP, 然后合成的cDNA經(jīng)過末端修復、加A、加測序接頭后，加入UNG(Uracil-N-Glycosylase) 降解第二鏈，通過瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇后進行PCR擴增，最后建好的測序文庫用Illumina 測序平臺進行測序。

1.2.6 差異表達LncRNA檢測 參照Audic S.等[7]基于測序的差異基因檢測方法檢測差異表達的LncRNA基因。將得到的P值進行多重假設檢驗校正，通過控制 FDR 來決定P值的閾值。

1.2.7 LncRNA功能注釋分析 采用Gene Ontology(GO) database (http:∥www.geneontology.org)數(shù)據(jù)庫對差異表達的LncRNA進行注釋分析，提取可調(diào)控cathpeisn D的LncRNA。

1.2.8 LncRNA-miRNA調(diào)控檢測 用miRanda (http:∥www.microrna.org/)和TargetScan (http:∥www.targetscan.org/)生物學軟件對慢性紫外線損傷細胞miR4298進行表達驗證，并對LncRNAs可靶向作用的miRNA預測分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件，UVA照射組與空白對照組間細胞活性、細胞老化率、凋亡率比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚成纖維細胞慢性光損傷模型的建立

UVA照射組細胞體積變大，細胞內(nèi)顆粒增多，出現(xiàn)慢性光損傷表型(圖1)。CCK8檢測結(jié)果顯示UVA照射組細胞活性[(60.02±5.13)%]明顯低于對照組[(89.06±4.21)%]，t=2.31,P<0.05。 β半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示，UVA照射組細胞老化率[(85.24±4.21)%]高于對照組[(8.16±1.62)%]，t=3.22,P<0.05，見圖2。流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示，UVA照射組細胞凋亡率[(26.04±7.42)%]高于對照組[(11.31±4.95)%]，t=3.54,P<0.05，見圖3。

圖1 UVA照射組細胞(1A)與對照組細胞(1B)相比，體積變大，細胞內(nèi)顆粒增多，胞質(zhì)藍染，出現(xiàn)慢性光損傷表型Fig.1 Compared with the control group (1B), UVA group (1A) cells had larger volume, more intracellular granules, blue staining of cytoplasm, and chronic light damage phenotype.

圖2 UVA照射組細胞(2A)較對照組細胞(2B)β-半乳糖苷酶染色陽性率增高Fig.2 The positive rate of β-galactosidase staining in UVA group (2A) was higher than that in control group (2B).

圖3 流式細胞檢測示UVA照射組(3A)細胞凋亡率較對照組細胞(3B)增高Fig.3 Flow cytometry showed that the apoptosis rate of UVA group (3A) was higher than that of control group (3B).

2.2 可調(diào)控cathepsin D的差異表達LncRNAs

應用高通量測序技術篩選慢性光損傷成纖維細胞與相應對照組之間差異表達的LncRNA，進而篩查出可調(diào)控cathepsin D且存在差異表達的LncRNA共有25個，其中表達差異較明顯的是Lnc-CTSD、Lnc-TNNI1和Lnc-RP11-706015.1.1-3,詳見表1。

表1 可調(diào)控cathepsin D的差異表達LncRNAsTab.1 LncRNAs of differential expression of regulated cathepsin D

2.3 LncRNAs通過靶向結(jié)合miR4298發(fā)揮調(diào)控作用

通過miRanda和TargetScan分析發(fā)現(xiàn)在慢性紫外線損傷細胞中， LncRNA-CTSD、Lnc-TNNI以及Lnc-RP11均通過與miR4298靶向結(jié)合發(fā)揮下游調(diào)控作用(表2)。

表2 慢性紫外線皮膚損傷細胞hsa-miR- 4298海綿吸附的LncRNAsTab.2 LncRNAs of adsorption of cells hsa-miR- 4298 sponges from chronic ultraviolet skin injury

3 討論

近年來，借助轉(zhuǎn)化醫(yī)學手段，非編碼RNA，包括LncRNA以及miRNA，作為一種新興的治療技術已邁進臨床試驗階段。利用miRNA、LncRNA及circRNA等非編碼RNA來調(diào)控cathepsins基因的表達，是目前最熱門和最有應用前景的技術，已被廣泛應用于基因功能調(diào)控和疾病干預等方面的研究，有些甚至已被利用開發(fā)出治療藥物。2014年，Grammatikakis等[8]指出，LncRNAs表達變化是細胞衰老分子標志的里程碑。鄭躍等[9]前期研究發(fā)現(xiàn)在皮膚光老化成纖維細胞中，有2 261個LncRNA有差異表達，并建立了光老化相關 LncRNA差異表達庫等。

cathepsin D是一種與表皮分化有關的蛋白質(zhì)，在反復紫外線照射后皮膚損傷和皮膚屏障變化中起重要作用。cathepsins是溶酶體內(nèi)最重要的蛋白水解酶家族之一，研究證實家族中的cathepsin D在溶酶體內(nèi)含量最豐富(溶酶體內(nèi)濃度高達1 mM)，cathepsin B 和cathepsin L酶原轉(zhuǎn)化為活性酶均有賴于cathepsin D催化，因此，cathepsin D 被稱為溶酶體“管家酶”。近年來的多項研究都已經(jīng)證明了cathepsin D家族在各器官系統(tǒng)細胞的自噬及水解過程中的重要作用。2015年Ma等[10]發(fā)現(xiàn)cathepsin D直接參與并調(diào)控細胞自噬，進而調(diào)控AGEs在溶酶體內(nèi)的降解，且AGEs 在溶酶體酸性環(huán)境中變性后更易與蛋白水解酶的肽鍵結(jié)合被降解[4]。本研究發(fā)現(xiàn)光老化細胞中Lnc-CTSD、Lnc-TNNI和Lnc-RP11表達上調(diào)，其表達基因與cathepsin D基因編碼序列非常接近，提示Lnc-CTSD、Lnc-TNNI和Lnc-RP11可能是UVA損傷皮膚組織蛋白酶表達變化的上游調(diào)節(jié)因子。

miR4298是一種人源microRNA，其已經(jīng)用于開發(fā)臨床疾病治療評估及預后試劑盒[5-6]。劉玉芳等[11]前期在進行光老化LncRNAs調(diào)控cathepsins研究時還發(fā)現(xiàn)，光老化特異性LncRNAs需要與microRNA結(jié)合，發(fā)揮下游效應，并發(fā)現(xiàn)靶向結(jié)合的microRNA-hsa-miR- 4298。hsa-miR- 4298是一種人源microRNA，已經(jīng)被用于開發(fā)臨床疾病治療評估及預后試劑盒。An等[5]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中表達的hsa-miR- 4298是胃癌預后的標志。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中表達的hsa-miR- 4298是腫瘤治療耐藥性及預后的標志之一。本研究通過信息學篩查，發(fā)現(xiàn)可調(diào)控cathepsin D的Lnc-CTSD、Lnc-TNNI和Lnc-RP11具有一個共同的靶向結(jié)合miroRNA：hsa-miR- 4298。提示hsa-miR- 4298可能通過結(jié)合Lnc-CTSD、Lnc-TNNI和Lnc-RP11調(diào)控cathepsin D參與皮膚慢性光損傷發(fā)生，但具體調(diào)控機制仍需進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，反復UVA照射可上調(diào)皮膚成纖維細胞中cathepsin D的調(diào)控LncRNAs，Lnc-CTSD、Lnc-TNNI1和Lnc-RP11-706015.1.1-3均通過與miR4298靶向結(jié)合發(fā)揮作用，可能通過microRNA-LncRNA-cathepsin D機制參與皮膚光老化發(fā)生。相信隨著 LncRNA、microRNA、cathepsin D與光老化機制的闡明，可更好地為研發(fā)更新、更穩(wěn)定、靶向性更強的皮膚光老化及日光相關性皮膚病(包括皮膚腫瘤)相關的分子標記物靶點提供依據(jù)，并能據(jù)此開發(fā)小分子藥物用于光老化及相關皮膚病的預防和治療，為其診斷和治療提供新契機。