響應(yīng)面優(yōu)化海風(fēng)藤多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

毛月東 金青

摘要：利用超聲輔助法提取海風(fēng)藤多糖，通過沙維積（Sevag）法分離、純化海風(fēng)藤多糖;以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面法對海風(fēng)藤多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用自由基體外清除試驗(yàn)對海風(fēng)藤多糖體外抗氧化性進(jìn)行探討。得出最佳超聲提取條件為提取時間50 min，液料比30 mL ∶1 g，提取溫度60 ℃，提取功率420 W;此條件下測得多糖平均得率為6.97%，相對偏差較小，該提取條件穩(wěn)定可靠。體外抗氧化試驗(yàn)表明，海風(fēng)藤多糖質(zhì)量濃度為 800 μg/mL 時，1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基與2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除率分別為81.20%、55.35%，表明海風(fēng)藤多糖具有較好的抗氧化作用。

關(guān)鍵詞：海風(fēng)藤;多糖;響應(yīng)面法;超聲提取;抗氧化

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）08-0171-06

收稿日期：2020-07-21

作者簡介：毛月東（ 1994—），女，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：mao17866859787@163.com。

通信作者：金 青，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：17854296528@163.com。

海風(fēng)藤是一種藥用藤本植物風(fēng)藤的干燥藤莖，味辛、苦，性微溫，能夠抗炎鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)祛濕、通經(jīng)活絡(luò)、抑制血小板活化因子，保護(hù)局部缺血組織等[1-2]。多糖是海風(fēng)藤的主要成分之一，多糖具有顯著的生物活性，在免疫調(diào)節(jié)、組織保護(hù)等生理過程中發(fā)揮著重要作用[3]，被廣泛應(yīng)用于各種保健產(chǎn)品和藥物中。

自由基是人體進(jìn)行正常生理活動時產(chǎn)生的，氧化性較強(qiáng)，人體內(nèi)自由基濃度較大時，就會損傷正常細(xì)胞和組織，引發(fā)一系列疾病，使人體衰老加快[4-5]。植物多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[6-7]，對體內(nèi)自由基有清除作用。本研究旨在通過響應(yīng)面法確定海風(fēng)藤多糖的最優(yōu)提取工藝，通過自由基清除試驗(yàn)研究海風(fēng)藤多糖的抗氧化活性，以期為海風(fēng)藤多糖的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)[8]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海風(fēng)藤：閩產(chǎn)海風(fēng)藤（2019年9月購于青島市李滄區(qū)同仁堂）;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（四川維克奇生物科技有限公司）;1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、維生素C、過硫酸鉀、苯酚、濃硫酸、雙氧水、無水乙醇、丙酮、三氯甲烷、正丁醇（以上試劑均為分析純）。

1.2 主要儀器

UV-6000 紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）;H-100S 超聲波清洗機(jī)（繁花科技有限公司）;DZF真空干燥箱（上海坤天實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 海風(fēng)藤多糖的制備

海風(fēng)藤烘干、粉碎、過篩，超聲加熱水提，減壓過濾、濃縮，使用活性炭進(jìn)行脫色，沙維積（Sevag）法脫蛋白，加入95%乙醇，置于冰箱4 ℃沉淀過夜，離心棄去上清液，將沉淀進(jìn)行真空干燥，得到海風(fēng)藤多糖。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

多糖含量的測定方法使用苯酚-硫酸法，將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品干燥至恒質(zhì)量，精確稱取100 mg，蒸餾水溶解，定容至100 mL，稀釋得到0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（2019年9月配制，保存于青島科技大學(xué)天然藥物化學(xué)研究室）。使用0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1 mL置于容量瓶中，加入5%苯酚1.5 mL，混勻，迅速滴加濃硫酸5 mL，充分混勻，50 ℃保溫30 min;流水冷卻至室溫，使用蒸餾水作為空白，490 nm測定吸光度，得到葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度的回歸方程y=7.043 8x+0.072 1，r2=0.999 3。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.01～0.1 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系[9]。

1.3.3 海風(fēng)藤多糖含量測定

稱取適量海風(fēng)藤粉末，按“1.3.1”方法制備海風(fēng)藤多糖溶液，按“1.3.2”方法對樣品溶液進(jìn)行測定，依據(jù)樣品溶液吸光度計算多糖含量，根據(jù)下式計算海風(fēng)藤多糖得率，計算公式如下：

海風(fēng)藤多糖得率=C×V/m×100%。

式中：C為海風(fēng)藤溶液多糖濃度（mg/mL）;m為海風(fēng)藤樣品質(zhì)量（mg）;V為提取液體積（mL）。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別設(shè)置不同超聲時間、溫度、功率以及液料比，探究其對海風(fēng)藤多糖得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)定海風(fēng)藤多糖得率為因變量，設(shè)置超聲時間（A）、液料比（B）、超聲溫度（C）、超聲功率（D）4個因素為響應(yīng)面自變量，采用四因素三水平中心組合響應(yīng)面法對海風(fēng)藤多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化（表1）。

1.3.6 海風(fēng)藤多糖純化

取制備的海風(fēng)藤多糖提取液，使用活性炭脫色，Sevag法脫蛋白，加入5倍量95%乙醇，4 ℃冰箱中靜置過夜，將脫蛋白溶液離心，棄去上清液，將下層沉淀進(jìn)行減壓干燥，得粗多糖，計算純化后多糖得率[10]。計算方法如下式：

純化海風(fēng)藤多糖得率=純化后海風(fēng)藤多糖質(zhì)量/海風(fēng)藤樣品質(zhì)量×100%。

1.3.7 海風(fēng)藤多糖抗氧化性研究

1.3.7.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)

稱取適量海風(fēng)藤多糖，配制不同濃度的海風(fēng)藤多糖溶液和 0.2 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液，取海風(fēng)藤多糖溶液和DPPH溶液各2 mL，混勻后靜置30 min，在 517 nm 測定吸光度D1，同樣方法測定2 mL 95%乙醇和2 mL海風(fēng)藤多糖溶液充分混勻后的吸光度為D2，2 mL DPPH 溶液與2 mL 蒸餾水混合后的吸光度為D0，同時用維生素C標(biāo)準(zhǔn)品作為對照[11-13]。

DPPH自由基清除率=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

1.3.7.2 ABTS自由基清除試驗(yàn)

將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L的K2S2O8溶液混合（體積比1 ∶1），在室溫條件下暗處反應(yīng)12～16 h，得到ABTS儲備液。ABTS儲備液用70%乙醇稀釋，直至在734 nm下測定的吸光度為0.7±0.02。精確量取1 mL樣品溶液，加入3 mL ABTS溶液，充分混勻，室溫下反應(yīng)6 min，測定734 nm吸光度為D1′，同法以蒸餾水代替樣品測定吸光度D0′，以溶劑代替樣品溶液測定吸光度D2′，維生素C作為對照，平行3次測定[14-15]。

ABTS自由基清除率=[1-（D1′-D2′）/D0′]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時間對海風(fēng)藤多糖得率影響

準(zhǔn)確稱取海風(fēng)藤粉末2.00 g，加入30倍量蒸餾水，設(shè)置超聲溫度60 ℃，超聲功率480 W，超聲時間分別為10、20、30、40、50 min進(jìn)行試驗(yàn)，每組處理3個重復(fù)。如圖1所示，海風(fēng)藤多糖得率隨超聲時間的增加呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢，當(dāng)超聲時間為40 min 時海風(fēng)藤多糖得率達(dá)到最大。其原因可能是當(dāng)提取時間較短時，多糖不斷從植物組織中釋放出來，故隨時間增加，多糖得率增加;但超聲波對大分子具有機(jī)械效應(yīng)，隨著超聲時間增長，超聲波對多糖分子造成破壞，從而使海風(fēng)藤多糖得率下降[16]。故提取時間為40 min時，海風(fēng)藤多糖提取效果最佳。

2.1.2 液料比對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取海風(fēng)藤粉末2.00 g，設(shè)置超聲溫度60 ℃，超聲時間 40 min，超聲功率為480 W，液料比分別為 10mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g進(jìn)行海風(fēng)藤多糖提取試驗(yàn)，每組處理3個重復(fù)。如圖2所示，海風(fēng)藤多糖得率隨液料比的增加，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在液料比為 30 mL ∶1 g 時達(dá)到最大。其原因可能是當(dāng)溶劑含量較少時，溶液黏度較大，多糖分子不易擴(kuò)散，得率較低。隨溶劑量增加，溶液黏度降低，擴(kuò)散快，得率高。液料比大于30 mL ∶1 g時，得率降低，可能是過多的溶劑會增加超聲波破碎細(xì)胞的阻力，使細(xì)胞破碎程度下降，降低多糖的溶出量[17]。故液料比在 30 mL ∶1 g 時，海風(fēng)藤多糖提取效果最佳。

2.1.3 溫度對得率的影響

準(zhǔn)確稱取海風(fēng)藤粉末2.00 g，設(shè)置液料比30 mL ∶1 g，超聲時間為 40 min，超聲功率為480 W，超聲溫度分別為40、50、60、70、80 ℃進(jìn)行海風(fēng)藤多糖提取試驗(yàn)，每組處理3個重復(fù)。如圖3所示，海風(fēng)藤多糖得率隨溫度增加先增大后減小，在提取溫度為60 ℃時海風(fēng)藤多糖得率達(dá)到最大。其原因可能是溫度較低時，隨著提取溫度的升高，分子熱運(yùn)動加快，多糖得率亦隨之增加，而溫度達(dá)到60 ℃以上時，可能由于溫度過高多糖結(jié)構(gòu)被氧化破壞，造成海風(fēng)藤多糖得率降低[18-19]。故溫度在60 ℃時，海風(fēng)藤多糖提取效果最佳。

2.1.4 超聲功率對得率的影響

準(zhǔn)確稱取海風(fēng)藤

粉末2.00 g，在液料比為30 mL ∶1 g，設(shè)置超聲溫度 60 ℃，超聲時間40 min，超聲功率分別為360、420、480、540、600 W進(jìn)行海風(fēng)藤多糖提取試驗(yàn)，每組處理3個重復(fù)。如圖4所示，海風(fēng)藤多糖得率隨超聲功率繼續(xù)增大呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，在功率為420 W時海風(fēng)藤多糖得率達(dá)到最大。其原因可能是超聲功率增大，超聲波的機(jī)械作用增強(qiáng)，對細(xì)胞的破碎作用增強(qiáng)，多糖得率增加。但隨著超聲功率增大，會加劇體系的空化作用，導(dǎo)致分子聚集并產(chǎn)生局部高溫。多糖分子受高溫影響容易失去活性并以沉淀形式析出，得率下降[20]。故超聲功率在 420 W 時，海風(fēng)藤多糖提取效果最佳。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化海風(fēng)藤多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果 采用響應(yīng)面法對海風(fēng)藤多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，不同工藝條件下海風(fēng)藤多糖提取試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)回歸系數(shù)，建立了響應(yīng)面回歸方程：海風(fēng)藤多糖得率Y=6.92+0.29A+0.17B+0.16C+0.16D-0.018AB+0.12AC-0.012AD-0.22BC-0.29BD-0.22CD-0.20A2-0.61B2-0.48C2-0.56D2。

由表3中的數(shù)據(jù)可知，此模型R2=0.999 4，P<0.000 1，失擬項（0.051 0）>0.01，說明該模型具有較高的可靠性，擬合效果良好。對各項影響因子的偏回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)分析結(jié)果表明：所選取的4個因素對多糖得率有極顯著影響，按影響程度從大到小依次為時間（A）>液料比（B）>功率（D）>溫度（C）;交互因素AC、BC、BD、CD對多糖得率的影響極顯著，這與李振等的研究結(jié)果[21]相符。

2.2.3 兩因素交互作用響應(yīng)面分析

當(dāng)響應(yīng)面圖的坡度越陡峭，等高線越密集，等高線呈扁圓形時，兩因素交互作用較顯著[22]。由圖5可知，圖5-c～圖5-f坡面陡峭，等高線密集，說明AC、BC、BD、CD交互作用對海風(fēng)藤多糖得率影響較為顯著，AB、AD交互作用對海風(fēng)藤多糖得率影響次之。

綜合回歸模型的分析可知，海風(fēng)藤多糖提取最優(yōu)工藝參數(shù)：提取時間為47.71 min，液料比為 30.68 mL ∶1 g，提取溫度為62.25 ℃，提取功率為 424.42 W，此條件下海風(fēng)藤多糖得率的理論值為7.06%。為驗(yàn)證分析結(jié)果的可靠性，考慮到試驗(yàn)方案的可行性，設(shè)定海風(fēng)藤多糖提取工藝參數(shù)：提取

時間為50 min，液料比為30 mL ∶1 g，提取溫度為 60 ℃，提取功率為420 W，測得多糖平均得率為6.97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=2.57%（n=5），相對偏差較小。因此該模型準(zhǔn)確度較高，可用于海風(fēng)藤多糖提取。

2.3 海風(fēng)藤多糖純化結(jié)果

按照“1.3.6”節(jié)的方法，對海風(fēng)藤多糖提取液進(jìn)行純化，純化后多糖得率為5.23%，純化后得率降低，說明脫色脫蛋白過程會對多糖造成破壞，使得多糖含量降低。

2.4 海風(fēng)藤多糖抗氧化活性研究

2.4.1 海風(fēng)藤多糖清除DPPH自由基試驗(yàn)

由圖6可知，隨著維生素C與海風(fēng)藤多糖濃度的不斷提高，二者對DPPH自由基的清除率不斷增高。維生素C質(zhì)量濃度在10～100 μg/mL時，DPPH自由基的清除率明顯提高，當(dāng)維生素C濃度超出 200 μg/mL 時，DPPH自由基清除率增加趨勢平緩。海風(fēng)藤多糖濃度在10～400 μg/mL 時，DPPH自由基的清除率明顯提高。當(dāng)海風(fēng)藤多糖濃度達(dá)到 800 μg/mL 時，二者對DPPH自由基的清除率分別是92.82%、81.20%。

2.4.2 海風(fēng)藤多糖清除ABTS自由基試驗(yàn)

由圖7可知，隨著維生素C與海風(fēng)藤多糖濃度的不斷提高，二者對ABTS自由基的清除率不斷增高。維生素C質(zhì)量濃度為10～200 μg/mL時，ABTS自由基的清除率明顯提高，當(dāng)維生素C濃度超過 400 μg/mL 時，ABTS自由基清除率增高較為平緩。海風(fēng)藤多糖質(zhì)量濃度在10～600 μg/mL，ABTS自由基的清除率明顯提高。當(dāng)濃度達(dá)到800 μg/mL時，維生素C、 海風(fēng)藤多糖對ABTS自由基的清除率分別是93.94%、55.35%。

3 結(jié)論

本研究利用超聲波輔助方法提取了海風(fēng)藤中多糖。通過對單因素試驗(yàn)的結(jié)果的分析，利用響應(yīng)面法得到海風(fēng)藤多糖最優(yōu)提取工藝條件：提取時間為50 min，液料比為30 mL ∶1 g，提取溫度為60 ℃，提取功率為420 W，多糖平均得率為6.97%。隨著海風(fēng)藤多糖質(zhì)量濃度的提高，對DPPH自由基與ABTS自由基清除效果也不斷增強(qiáng)，當(dāng)海風(fēng)藤多糖質(zhì)量濃度為800 μg/mL時，DPPH自由基與ABTS自由基清除率分別為81.20%、55.35%。由此說明海風(fēng)藤多糖具有一定抗氧化性，為海風(fēng)藤多糖開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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