2019年四川省部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因的遺傳變異分析

孔軍 朱國坡 康斌 武玉梅 李少麗 邵攀峰 尹忠良

摘要：為了解2019年四川省豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）ORF5基因的遺傳變異情況，采用RT-PCR方法對來自該省部分地區(qū)豬場的36份疑似PRRS豬的組織樣品進行PRRSV ORF5基因測序，并對所獲得的基因序列進行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，成功擴增出14條PRRSV ORF5基因片段。同源性分析顯示，14條PRRSV ORF5基因序列均為基因Ⅱ型毒株，分屬于1、3、8這3個不同的譜系，以NADC30為代表的譜系1和以QYYZ為代表的譜系3各5株，以JXA1為代表的譜系8毒株4株，各毒株間核苷酸和推導(dǎo)氨基酸的同源性分別為78.5%～100.0%、78.0%～100.0%。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，14個毒株GP5蛋白上3個主要的抗原表位上均存在廣泛的變異，同時譜系1和譜系3毒株與毒力相關(guān)的位點也發(fā)生了不同程度的突變，這些突變可能影響病毒毒力及有助于病毒逃避機體的免疫系統(tǒng)。結(jié)果表明，2019年四川省PRRSV呈多亞型毒株同時流行的復(fù)雜局面，有必要對PRRSV的流行和變異情況進行實時監(jiān)測，以此選擇更為合適的疫苗毒株及免疫程序，結(jié)合嚴(yán)格的生物安全措施，從而達到科學(xué)防控PRRS的效果。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒;ORF5基因;遺傳變異

中圖分類號： S858.285.3文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）08-0068-05

收稿日期：2021-01-18

基金項目：浙江省重點研發(fā)計劃（編號：2020C02011）

作者簡介：孔 軍（1974—），女，山西襄汾人，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防控工作。E-mail：guobo916@163.com。

通信作者：康 斌，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疫苗開發(fā)。E-mail：kangb@jinheuben.com。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一種可引起以母豬繁殖系統(tǒng)疾?。鳟a(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等）和各年齡豬的呼吸系統(tǒng)疾病為特征的重大動物傳染性病原。由PRRSV引起的疾病稱作豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），該病于20世紀(jì)80年代在歐美首次報道[1-2]，隨后短短數(shù)年在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

PRRSV全基因組長度約15 kb，至少包含ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7，以及ORF5a等10個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）。其中，ORF1a和ORF1b編碼PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，NSP）NSP1α、NSP1β、NSP2～NSP6、NSP7α、NSP7β、NSP8～NSP12，ORF2a、ORF2b、ORF3～ORF7分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白GP2、E、GP3、GP4、GP5、GP5a、M和N等[3-4]。NSP2和GP5分別是PRRSV易于變異的非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，常被用于開展病毒的流行病學(xué)調(diào)查與遺傳演化分析。

根據(jù)來源，PRRSV可分為歐洲型（基因Ⅰ型）和北美型（基因Ⅱ型），它們的代表毒株分別為Lelystad Virus（LV）和VR-2332，2個基因型間的核苷酸同源性約60%，但引起的臨床癥狀相似[5]。Shi等根據(jù)ORF5基因?qū)⒈泵佬蚉RRSV進一步分為9個譜系（Lineage）[6]。我國的北美型PRRSV流行毒株包括4個譜系，即譜系1（代表毒株NADC30）、譜系3（代表毒株QYYZ）、譜系5（代表毒株VR-2332）和譜系8（代表毒株JXA1）[7-8]。

1996年，我國首次報道并分離到PRRSV CH-1a毒株[9]。2006年，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）在我國開始出現(xiàn)，引起發(fā)病豬持續(xù)高熱、高發(fā)病率和高死亡率[10]，該病迅速傳遍全國，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重打擊。研究表明，與CH-1a毒株相比，HP-PRRSV以NSP2不連續(xù)缺失了30個氨基酸為特征[11-12]。2012年前后，以NSP2不連續(xù)缺失131個氨基酸為特征的新PRRSV毒株開始在我國出現(xiàn)，該毒株與美國NADC30具有相同的基因缺失模式，我國學(xué)者稱之為類NADC30毒株（NADC30-like）[13]，NADC30-like易與其他類型的PRRSV毒株發(fā)生重組變異，造成疫苗免疫失敗，引起新的PRRS發(fā)病。當(dāng)前，NADC30-like已成為我國一些地區(qū)優(yōu)勢流行毒株[8]。

本研究對2019年四川省部分地區(qū)PRRS疫苗免疫豬場采集的疑似PRRS發(fā)病豬的病變組織進行PRRSV ORF5基因的擴增和測序，并將所獲得毒株的ORF5基因序列與參考毒株序列進行比對和遺傳變異分析，為該省的PRRS防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品 來自2019年四川省廣安、內(nèi)江、眉山、雅安、廣元、達州、綿陽等地疑似發(fā)生PRRS（伴有發(fā)熱、呼吸系統(tǒng)癥狀、妊娠母豬流產(chǎn)等現(xiàn)象）豬的肺臟、淋巴結(jié)、流產(chǎn)胎兒等組織樣品，共36份，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 載體、感受態(tài)細胞 pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細胞均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 主要試劑 病毒RNA/DNA提取試劑盒、1st Strand cDNA合成試劑盒、DL-2000 Marker、Ex Taq酶，均購自寶生物工程（大連）有限公司;DNA純化回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 依據(jù)GenBank中發(fā)布的PRRSV VR-2332（U87392）、NADC30（JN654459）、JXA1（EF112445）等毒株的基因序列，并參照周峰的方法[13]，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了1對用于擴增ORF5基因的特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。GP5-F：5′-GTGTCAGGCATTGTGGCTGTG-3′;GP5-R：5′-CATTATTGGCGTGTAGGTKATRGAAAA-3′;預(yù)擴增片段大小約為864 bp。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA合成

將預(yù)先稱質(zhì)量的組織樣品剪碎、研磨，加入2倍組織質(zhì)量的無菌PBS溶液，振蕩混勻，-80 ℃反復(fù)凍融3次，4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，取上清備用。按照病毒RNA/DNA提取試劑盒的方法對組織上清進行總RNA的提取。

以總RNA為模板，采用1st Strand cDNA試劑盒制備cDNA。在反應(yīng)管中配制以下試劑（20.00 μL）：Random 6 mers 1.00 μL，dNTP Mixture 1.00 μL，RNase Free H2O 4.00 μL，模板4.00 μL;65 ℃保溫5 min，冰上冷卻;向管中再加入5×PrimeScript Ⅱ Buffer 4.00 μL，RNase Inhibitor 0.52 μL，PrimeScriptⅡRTase 1.00 μL，RNase Free H2O 4.48 μL;緩慢混勻，30 ℃ 10 min，45 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，冰上冷卻，即為cDNA模板，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ORF5基因的RT-PCR擴增

以cDNA為模板，利用GP5-F/GP5-R引物擴增ORF5基因。反應(yīng)體系如下（30.00 μL）：ddH2O 18.96 μL，10×Ex Taq buffer 3.00 μL，dNTP Mix 2.40 μL，GP5F 120 μL，GP5R 1.20 μL，Ex Taq 0.24μL，cDNA 300 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 10 min。取擴增產(chǎn)物5.00 μL采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并觀察結(jié)果。

1.2.4 ORF5基因PCR產(chǎn)物的回收、克隆和測序

應(yīng)用通用型DNA純化回收試劑盒對ORF5基因陽性樣品的PCR擴增產(chǎn)物進行純化回收，并將回收的DNA片段連接在pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中。采用GP5-F/GP5-R引物對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，將陽性質(zhì)粒的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行ORF5基因測序。

1.2.5 PRRSV ORF5基因序列的比對與分析

應(yīng)用DNA Star7.1軟件中的MegAlign對所獲得的PRRSV毒株和GenBank中部分代表毒株的ORF5基因序列進行同源型和推導(dǎo)氨基酸的同源型分析，并對毒株的推導(dǎo)氨基酸進行遺傳變異分析。應(yīng)用MEGA 6.06軟件的ClustalW對所獲得的PRRSV毒株的ORF5基因核苷酸序列進行比對，并應(yīng)用Neighbor-Joining法（Bootstrap=1 000）對其進行遺傳演化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床疑似PRRS樣品ORF5基因的RT-PCR擴增結(jié)果

用RT-PCR方法對36份疑似PRRS發(fā)病豬組織樣品進行了ORF5基因檢測，陽性樣品14份，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符，部分樣品ORF5基因的擴增結(jié)果見圖1。

2.2 ORF5基因遺傳進化分析

將14個陽性樣品ORF5基因與GenBank中發(fā)布的國內(nèi)外部分代表毒株的ORF5基因核苷酸序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，由圖2可知，全部14個毒株均屬基因Ⅱ型。其中，5個毒株（SCms0501、SCms0801、SCms0802、SCga0401、SCya0301）屬于以NADC30為代表的譜系1（占35.7%），5個毒株（SCgy0701、SCmy1101、SCdz1002、SCnj0901、SCya0302）屬于以QYYZ為代表的譜系3（占357%），4個毒株（SCdz0301、SCdz0302、SCdz1001、SCmy1102）屬于以JXA1為代表的譜系8（占286%）。本研究中未檢測到以VR-2332為代表的譜系5毒株。

2.3 ORF5基因同源性分析

試驗所獲得的14個PRRSV毒株中的13個毒株ORF5序列全長為603 bp，編碼200個氨基酸，1個毒株（SCya0301）ORF5序列全長為600 bp，編碼199個氨基酸。14個毒株之間的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸的同源性分別為78.5%～100.0%、78.0%～100.0%。依據(jù)系統(tǒng)進化樹對所獲得毒株ORF5基因進行分類比對分析，由圖3、圖4可知，譜系1的5個毒株與其代表毒株NADC30的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別為92.0%～94.2%、91.5%～945%，譜系3的5個毒株與其代表毒株QYYZ的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別為90.5%～942%、90.5%～94.0%，譜系8的4個毒株與其代表毒株JXA1的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別為97.3%～99.2%、97.5%～98.5%。

2.4 ORF5基因推導(dǎo)氨基酸的遺傳變異分析

據(jù)報道，北美型PRRSV GP5蛋白上含有3個重要的抗原表位，1個中和表位（B表位，aa37～45），2個非中和表位：aa27～30（A表位）和aa180～197（C端抗原表位）[14]，這些表位存在于蛋白的高變區(qū)中[15]。本研究通過對所獲得的14個毒株與代表毒株的氨基酸序列比對分析，由圖5、圖6可知，各毒株GP5蛋白的3個表位均存在不同程度氨基酸突變。在非中和表位A區(qū)域，氨基酸突變更為明顯，與 VR-2332 相比，譜系1的所有毒株均發(fā)生了V27A、A29V突變，譜系8的所有毒株均發(fā)生了A29V的突變，譜系3的各毒株之間僅有第28位氨基酸相同，為L28，其他氨基酸位點在毒株之間有較大變異。在B表位區(qū)域，各譜系毒株存在各自特征性氨基酸，其中L39為譜系1毒株的特征性氨基酸，Y38和S39為譜系3毒株的特征性氨基酸，I39為譜系8毒株的特征性氨基酸。

GP5蛋白上R13和R151氨基酸與PRRSV的毒力有關(guān)[16]，它們的改變可能會導(dǎo)致病毒毒力的減弱[15]。與VR-2332相比，本研究的6個毒株發(fā)生了R13Q突變，7個毒株發(fā)生了R151K的突變，1個毒株發(fā)生了R151Q的突變，1個毒株發(fā)生了R151N的突變，其中譜系1的4個毒株的2個位點均發(fā)生了突變。

本研究中毒株YNrl-03-1 GP5蛋白中和表位B存在1個氨基酸的缺失（aa37），該缺失對宿主中和抗體生成的影響有待進一步研究。

3 討論

1996年，我國首次分離到PRRSV CH-1a毒株后，豬繁殖與呼吸綜合征長期困擾著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。由于PRRSV的RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）缺乏 3′-5′ 校正功能的復(fù)制特性，及準(zhǔn)種、重組等原因，我國的PRRSV毒株表現(xiàn)為多樣性。

我國的北美型PRRSV主要包含4個譜系，在譜系1 NADC30-like毒株出現(xiàn)以前，譜系8的HP-PRRSV是我國田間的優(yōu)勢流行毒株。NADC30-like毒株極易與田間野毒或疫苗毒發(fā)生重組變異，該毒株出現(xiàn)后短短幾年就成為我國某些地區(qū)的優(yōu)勢流行毒株[8，17-18]。QYYZ類毒株，及由MLV RespPRRS/Repro疫苗毒和野毒重組的GM2毒株[20]，具有高致病性特點，是最早在我國南方地區(qū)出現(xiàn)的PRRSV變異株，與經(jīng)典PRRSV、HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV毒株的遺傳距離比較遠，處于進化樹的獨立分支上（譜系3）。本研究共獲得了14個PRRSV分離株，其中，譜系1（5個）、譜系3（5個）、譜系8（4個），各譜系毒株的檢出數(shù)無明顯差別。值得注意的是，與之前相比譜系3毒株（以QYYZ為代表）檢出率有增多趨勢，需要持續(xù)加強監(jiān)測[15，20]。本研究在某集團豬場的不同分場檢測到相同的PRRSV毒株（SCms0501、SCms0801、SCms0802），推測可能是由豬的調(diào)運引起，提示集團豬場內(nèi)部調(diào)豬時進行必要的隔離檢疫、消殺等生物安全防控措施的重要性。

GP5蛋白是宿主主要的保護性抗原，存在主要的抗原表位（A表位、B表位和C端抗原表位），這些抗原表位均存在于不同的基因高變區(qū)中。GP5蛋白氨基酸序列的任何改變就可能影響病毒的感染性和疫苗的交叉保護率，甚至引起免疫失敗[21-23]。在病毒感染的早期，A表位起主導(dǎo)作用，可抑制B表位被免疫系統(tǒng)識別，推遲中和抗體的產(chǎn)生，進而有助于病毒逃避免疫系統(tǒng)[24]。通過對所獲得毒株的氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，14個毒株GP5蛋白主要抗原表位均發(fā)生了較多的氨基酸突變，這些突變可能影響了PRRSV的免疫原性，引起已免疫PRRS疫苗的穩(wěn)定場再次發(fā)病。與毒力相關(guān)R13和R151位點上，譜系8的所有毒株具有此氨基酸特征，均為R，但譜系1和譜系3的所有毒株的2個毒力相關(guān)位點均發(fā)生了不同程度突變，推測這些關(guān)鍵位點的突變可能是當(dāng)前流行毒株毒力低于HP-PRRSV毒力的主要原因。

在非洲豬瘟疫情影響下，我國養(yǎng)豬企業(yè)加強了生物安全和綜合性防控措施，PRRS在我國的流行和發(fā)生比較平穩(wěn)，甚至呈下降趨勢[17]。但在豬場急于補欄、引種調(diào)運，生物安全防范措施執(zhí)行不到位的情況下，豬場時有PRRS疫情的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，2019年四川省PRRSV毒株流行情況非常復(fù)雜，以JXA1為代表的HP-PRRSV不再是該省的優(yōu)勢流行毒株，與2018年的報道[15]有一定出入，也許是由組織樣品的選取差異造成，研究中NADC30-like和類QYYZ變異株檢出率明顯增加，形成了譜系1、3、8 PRRSV共同流行的局面。據(jù)報道，商品化疫苗對譜系1和3毒株的保護效果有限，疫苗免疫的豬場存在再發(fā)PRRS疫情的現(xiàn)象[25]。因此，有必要對該省PRRSV毒株的流行和變異情況進行持續(xù)監(jiān)測，以此選擇更為合適的疫苗毒株及免疫程序，同時在引種、調(diào)運時執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全措施，從而達到科學(xué)防控PRRS效果。

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