體外模擬消化對藜麥抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性影響研究

王 靜 劉丁麗 羅 丹 成 婧 陸 俊 Otobong Donald Akan 羅非君

(林產(chǎn)可食資源安全與加工利用湖南省重點實驗室1，長沙 410004)(中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院2，長沙 410004)(中國農業(yè)科學研究院農產(chǎn)品加工研究所3，北京 100193)(湖南省檢驗檢疫科學技術研究院4，長沙 410004)

近年來，由于谷物食品對糖尿病、肥胖癥、心血管疾病等與生活方式和飲食習慣相關的疾病具有潛在抑制作用而被視為健康食品。因此，從谷物中發(fā)現(xiàn)的具有保健功效的生物活性成分已成為越來越多科研工作的研究熱點。藜麥(ChenopodiumQuinoawild)原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈，是安第斯人的傳統(tǒng)主食，與其他常見谷物相比，藜麥營養(yǎng)價值更高，含有60%左右的淀粉類化合物、約15%的優(yōu)質蛋白質、約10%的脂質且主要為不飽和脂肪酸，核黃素、維生素E、葉酸等維生素類物質也高于一般谷物、富含礦物質(鈣、鎂、鐵、鉀等)等成分，近年來引起了廣泛關注并被其他國家引種，在我國青海、西藏、山西等地均有種植。許多地區(qū)將藜麥看作一種“功能性食品”[1]，因其具有抑制前列腺癌細胞增殖[2]，調節(jié)血糖，降低膽固醇，保護心腦血管等諸多益處[3]。研究表明，藜麥的主要活性成分有多酚、黃酮、皂苷、多糖和可溶性纖維[4]，其多酚含量與抗氧化能力呈正相關[5]。多酚具有清除自由基、減少體內外氧化損傷、預防機體發(fā)生與氧化有關的慢性疾病等能力[6]，而藜麥種子中含有槲皮素、山奈酚、香草醛酸、阿魏酸、阿魏酸-4-葡萄糖苷等多種酚類化合物[7，8]。此外，有報道稱酚類化合物可作為糖苷酶抑制劑，用于降低由腸道淀粉消化引起的餐后高血糖[9，10]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是參與小腸碳水化合物消化降解的關鍵酶[11]，抑制它們的活性就可以減緩淀粉分解，降低糖尿病患者餐后血糖水平。

現(xiàn)階段，藜麥研究大多數(shù)集中在其物理和化學特性[12，13]、營養(yǎng)成分、功能性[14]、加工工藝對活性成分的影響[15，16]等方面。大多數(shù)生物活性物質在發(fā)揮其生物活性之前都要經(jīng)過胃腸道消化，不同產(chǎn)地、不同研究得到的藜麥功能活性成分含量也不盡相同。因此，本研究旨在探討經(jīng)過體外模擬胃腸道消化，藜麥中的酚類化合物、黃酮類化合物、抗氧化作用以及對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用的差異，為藜麥作為功能性食品原料改善人體健康提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種脫殼藜麥(均為白藜麥)分別產(chǎn)自青海、山西和玻利維亞(進口)。福林-酚試劑、ABTS(超純)、蘆丁(≥98%)、沒食子酸(≥99.3%)、兒茶素(≥98%)、水溶性維生素E(≥98%)、2, 4, 6-三吡啶三嗪(tripyridyltriazine，TPTZ，≥98%)、DPPH(>97%)；豬胰酶(250 N.F.U/mg)、胃蛋白酶(800～2 500 U/mg)、α-淀粉酶(>10 U/mg)、α-葡萄糖苷酶(>50 U/mg)、透析袋(YA1082-5M，MWCO 1000)，其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

UV1800紫外可見分光光度計,JY92-Ⅲ超聲波細胞粉碎機,AuY220電子分析天平。

1.3 方法

1.3.1 未消化樣品的制備

準確稱取10 g藜麥種子粉末(40目)放入錐形瓶中，加入50 mL含0.1% HCl的70%甲醇溶液，在500 W下超聲40 min，在12 000 r/min下離心15 min，取上清液，按照相同步驟再次提取沉淀物，合并兩次提取液作為藜麥未消化樣品。

1.3.2 體外模擬胃、腸消化

根據(jù)Miller等[17]的方法作適當修改進行模擬消化。第一部分是模擬胃液消化，取20 g藜麥粉末和200 g生理鹽水在燒杯中充分混勻，進行沸水浴并持續(xù)攪拌15 min。待樣品溶液冷卻后，加入去離子水調至220 g。用1 mol/L HCl將樣品懸濁液的pH值調至2.0，再加入1 mL模擬胃液(0.5 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L的HCl)。鹽酸對照組用1.0 mL 0.01 mol/L的HCl代替模擬胃液，空白對照組用1 mL的去離子水替代鹽酸和胃液。錐形瓶用錫紙包裹避光，在37 ℃、100 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器中消化2 h，離心收集上清液，再加無水乙醇(最終濃度高達60%)并放入冰箱中反應6 h以除去糖和蛋白質，離心取上清液作為胃消化組、鹽酸對照組和空白對照組樣品進行分析。

第二部分是模擬腸道消化，透析袋中注入8 mL生理鹽水和2.0 mL 0.1 mol/L NaHCO3溶液再將透析袋浸入上述胃消化液中，在37 ℃、100 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩45 min。然后，在透析袋外的胃消化液中加入5 mL胰液膽汁混合液(0.4 g胰酶，2.5 g膽汁提取物溶于100 mL 0.1 mol/L的NaHCO3溶液中)模擬腸消化，腸空白組則加入5 mL 0.1 mol/L的NaHCO3溶液。兩組均在37 ℃、100 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器中消化2 h。最后，透析袋內外的液體去除蛋白，離心后留上清液備用，以透析袋外液分別作為腸消化組和腸空白組樣品。

1.3.3 總多酚和總黃酮的測定

參考文獻[18]測定總多酚(TPC)和總黃酮(TFC)，以沒食子酸標準物質對多酚含量進行定量，結果表示為每克干重樣品的沒食子酸毫克當量(mg GAE/gmd)；用兒茶素標準物質對總黃酮進行定量，結果以每克干重樣品中兒茶素毫克當量表示(mg CE/gmd)。

1.3.4 生物利用率的測定

生物利用率是指人體吸收利用的有效成分總量占食品中有效成分總量的比例[19]。通過一個簡單的動力學模型，利用透析袋模擬胃腸道在體內的消化吸收，研究體外消化對藜麥營養(yǎng)物質吸收利用的影響。其生物利用率按式(1)計算。

(1)

式中：C1和C2分別為透析袋內、透析袋外的TPC或TFC/mg。

1.3.5 抗氧化活性的測定

選擇常用的三種抗氧化方法DPPH，ABTS，F(xiàn)RAP進行抗氧化活性的測定，具體操作根據(jù)文獻[18]進行，用Trolox 作標準物質，結果以每克干重樣品中微摩爾Trolox當量表示(μmol TE/gmd)。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶的抑制活性的測定

根據(jù)Yang等[20]的方法測定α-葡萄糖苷酶的抑制活性。200 μL樣品提取液和200 μL 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶(溶于0.01 mol/L pH=6.8磷酸鈉緩沖溶液)，37 ℃反應15 min，再加入200 μL 2.5 mmol/L 對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖(pNPG)溶液。37 ℃反應10 min后，加入5 mL 0.10 mol/L NaCO3溶液終止反應，在400 nm處測定吸光度A。空白組用去離子水代替樣品提取液，對照組用緩沖液代替酶。抑制率的計算見式(2)。

表1 藜麥的TPC、TFC以及抗氧化活性

α-葡萄糖苷酶的抑制率=

(2)

1.3.7 α-淀粉酶抑制活性測定

α-淀粉酶抑制活性根據(jù)Tao等[21]的方法測定。1.0 mL樣品提取液與0.3 mL的α-淀粉酶(溶于pH=6.8的磷酸鹽緩沖液)在37℃下放置5 min，加0.4 mL 1%淀粉溶液在37℃下反應15 min。再加入0.5 mL DNS試劑(1.575 g 3,5-二硝基水楊酸溶于5.25 g的NaOH溶液中，加入含有45.5 g酒石酸鉀鈉熱溶液125 mL，再加入1.25 g苯酚和1.25 g亞硫酸鈉，攪拌均勻加熱至溶解，冷卻后定容至250 mL，儲存于棕色瓶中，放置一星期后使用)，混合溶液沸水浴5 min，冷卻至室溫，去離子水定容至25 mL，在540 nm處測量吸光度。用去離子水代替藜麥提取液作為空白組，去離子水代替α-淀粉酶溶液作對照組，抑制率按式(3)計算。

α-淀粉酶的抑制率=

(3)

1.3.8 統(tǒng)計分析

所有實驗做3次平行，所得數(shù)據(jù)用平均值±標準差(SD)表示。采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，采用Spearman相關系數(shù)進行相關性檢驗。P<0.05表示有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 藜麥提取物的總酚、總黃酮含量及抗氧化活性

經(jīng)過超聲波輔助酸化甲醇提取后，藜麥的TPC、TFC和抗氧化活性結果如表1所示。3個品種中，青海藜麥的TPC最高，玻利維亞藜麥的TPC最低，其值均高于意大利皮亞琴察(Piacenza)藜麥粉的多酚含量(87.2 mg/100 g)[22]。青海、山西、玻利維亞藜麥的TFC含量遠高于Abderrahim等[23]的報道(47～255 mg/100 g)。在一定程度上，不同的提取方法、不同產(chǎn)地或藜麥的基因型可能會造成這種差異。3種藜麥的抗氧化活性也存在一定差異，DPPH自由基清除活性從高到低依次為青海藜麥>山西藜麥>玻利維亞藜麥(表1)。ABTS自由基清除活性則依次為山西藜麥>青海藜麥>玻利維亞藜麥。FRAP法所得結果與ABTS有相似的趨勢，山西藜麥的抗氧化活性最高，玻利維亞藜麥的抗氧化活性最低，與Zhao等[24]的結果(12.74～16.57 μmol TE/gmd)相近，高于秘魯高原的黃色藜麥[(12.5±2.3)μmol TE/g]和紫紅色藜麥[(18.4±1.7)μmol TE/g]的值[25]?？寡趸钚灾g的差異可能是由于多酚和類黃酮等抗氧化活性物質含量的不同引起的，也可能是由產(chǎn)地、提取方法、品種等差異造成的。

2.2 模擬消化后總酚、總黃酮的釋放及生物利用率

3種藜麥在體外模擬消化后的TPC和TFC含量如圖1所示。隨著消化的進行，TPC和TFC含量均逐漸升高。在胃消化過程中，青海、山西、玻利維亞藜麥的TPC分別比未消化組增加了102.73%、91.07%、168.93%，TFC分別比未消化組增加了127.03%、113.31%、194.36%。其中玻利維亞藜麥胃消化后的TPC和TFC增幅最大，而青海藜麥的值最高。雖然青海藜麥、山西藜麥的鹽酸組和胃消化組的TFC無顯著性差異，但胃消化組的TFC值仍高于鹽酸組。在胃蛋白酶催化作用下，可能會使更多的多酚和黃酮釋放到模擬胃液中。

腸消化過程中TPC和TFC持續(xù)升高。青海、山西、玻利維亞藜麥腸消化組的TPC分別比未消化組增加了202.41%、178.41%、270.38%，同時，TFC分別比未消化組增加了219.86%、236.79%和352.84%，也顯著高于胃消化組。值得注意的是，除了青海藜麥和山西藜麥的TFC值外，腸消化組和腸空白組之間沒有顯著差異，這可能是由于空白組的堿性環(huán)境與模擬腸液中的胰酶等物質對多酚的釋放有類似影響，或者是胰酶對TFC釋放的影響較大，對TPC影響較小。

注：同一評價指標的不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)，同一柱形圖上的不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖1 體外模擬消化前后藜麥的TPC和TFC

模擬胃腸體外消化后，3種藜麥的TPC和TFC值顯著升高，這與Pellegrini等[26]所發(fā)現(xiàn)的變化趨勢一致。消化組總酚含量的增加可能是由于胃蛋白酶的水解作用或堿性消化環(huán)境有利于酚類物質從復雜的食物基質中釋放出來。同時，大多數(shù)腸消化組和腸空白組的TPC和TFC值無顯著性差異，這可能是由于腸道消化組中的總酚和總黃酮轉移到了透析袋里面。在整個胃腸消化期結束時，玻利維亞藜麥、山西藜麥和青海藜麥總酚的17.50%、19.02%和20.49%，總黃酮的32.15%，32.13%和32.00%進入到透析袋內，且略高于腸空白組，即這些成分是可以被吸收的。由此可知，體外消化可以提高藜麥活性物質在腸道水平上的消化吸收。

2.3 模擬消化對藜麥抗氧化活性的影響

模擬消化對藜麥抗氧化活性影響的結果如圖2所示。抗氧化活性值隨著消化過程的進行而逐漸升高，呈現(xiàn)出腸消化組明顯高于胃消化組和未消化組的大致趨勢。青海藜麥、山西藜麥和玻利維亞藜麥的DPPH抗氧化活性以腸消化組抗氧化活性最高，比相應的未消化組分別提高了124.27%、85.22%和96.39%，且顯著高于相應的胃消化組。同樣的，經(jīng)腸消化后，3種藜麥的ABTS抗氧化活性分別比未消化組提高了86.38%、55.18%和37.36%。腸消化組的ABTS清除能力略高于腸空白組和胃消化組，這可能是因為在腸消化組有更多的抗氧化成分滲入透析袋導致透析袋外(即腸消化組)的抗氧化成分減少所致。FRAP抗氧化能力則表現(xiàn)出與DPPH法相似的趨勢，但增長幅度較小。3種藜麥透析袋內溶液的抗氧化能力分別占透析袋外溶液總抗氧化能力的19.13%～23.16%(DPPH)，26.50%～32.47%(ABTS)，12.87%～17.58%(FRAP)，均略高于腸空白組，說明有更多的抗氧化成分進入透析袋并在腸消化時可發(fā)揮生物活性作用。

注：同一檢測方法的不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05);同一柱形圖上的不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖2 體外模擬消化前后藜麥的抗氧化活性

這些結果表明通過胃蛋白酶、胰蛋白酶和膽鹽的消化可能有助于將更多的酚酸、黃酮等抗氧化成分從藜麥種子中釋放出來，而多酚物質與藜麥的抗氧化能力呈正相關，因此體外抗氧化活性也有所提高。在本研究中，Spearman相關性分析也證實了3種抗氧化活性(DPPH、ABTS和FRAP)與多酚之間的高度相關性(P<0.01)(相關系數(shù)分別為0.913，0.960和0.933)。

2.4 藜麥對α-葡萄糖苷酶抑制作用

消化的各個階段，3種藜麥對α-葡萄糖苷酶抑制作用的結果如圖3所示。所有受試組對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力均呈現(xiàn)劑量依賴性關系(圖3)。未消化組中，以玻利維亞藜麥的抑制能力最強，IC50值最低(27.43 mg/mL)。模擬胃消化后，3種藜麥在各個濃度下對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均明顯增強，仍以玻利維亞藜麥抑制能力最強，具有最低IC50值(21.90 mg/mL)。同時，所有實驗組的IC50均低于相應的未消化組。在進一步模擬腸道消化后，IC50值繼續(xù)下降，表明其比胃消化組的抑制活性更強，以山西藜麥腸消化組的抑制活性最強，IC50值最低(16.24 mg/mL)。這些結果表明，模擬胃腸道消化后，藜麥對α-葡萄糖苷酶的抑制活性明顯增強。

圖3 體外模擬消化前后藜麥對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

2.5 藜麥對α-淀粉酶的抑制活性

3種藜麥對α-淀粉酶的抑制活性也均呈現(xiàn)劑量效應關系(圖4)。3種藜麥未消化組的IC50為11.43～27.43 mg/mL，低于抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值，說明藜麥對α-淀粉酶的抑制能力強于α-葡萄糖苷酶。經(jīng)胃消化后，抑制活性略有提高，3種藜麥的IC50值均低于未消化組，同樣的，胃消化組中抑制α-淀粉酶的IC50值也低抑制于α-葡萄糖苷酶的IC50值。綜上可知，在模擬胃液消化的條件下，藜麥胃消化產(chǎn)物對α-淀粉酶的抑制活性明顯增強，且相比α-葡萄糖苷酶，對α-淀粉酶的抑制能力更強。

圖4 體外模擬消化前后藜麥對α-淀粉酶抑制率的影響

然而，藜麥對α-淀粉酶的抑制活性并沒有隨著消化的進行而繼續(xù)提升，反而有所降低。在模擬腸道消化階段，玻利維亞藜麥在20 mg/mL時抑制率為59.46%，明顯低于胃消化組的75.13%。 相應的IC50值為10.67 mg/mL，也顯著大于胃消化組的IC50(6.53 mg/mL)。青海藜麥和山西藜麥與玻利維亞藜麥有相似的趨勢，IC50分別為8.17、9.17 mg/mL，均略高于各自胃消化組的IC50(分別為6.77、6.99 mg/mL)。這些結果表明，經(jīng)過腸消化，藜麥對α-淀粉酶的抑制活性有所降低。這有可能是部分具有抑制α-淀粉酶活性的成分由透析外液進入透析袋內，引起透析外液(腸消化組)抑制活性減弱，同時的透析袋內的抑制活性增強(3種藜麥透析袋內液的IC50值分別為7.34、5.40、6.23 mg/mL)。這些結果也表明，藜麥腸消化后更容易被腸道利用以發(fā)揮其抑制α-淀粉酶的活性。此外，比較兩種酶的IC50值可知所有藜麥的腸道消化組對α-淀粉酶的IC50值均顯著低于α-葡萄糖苷酶，表明藜麥消化后對α-淀粉酶的抑制活性要強于對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制劑可以減緩腸道內碳水化合物的消化從而降低餐后血糖濃度。藜麥對α-淀粉酶的抑制作用鮮有文獻報道。Hemalatha等[27]研究了印度白藜麥麩皮和殼提取物對α-淀粉酶(IC50值分別為108.68和148.23 μg/mL)和α-葡萄糖苷酶(IC50值分別為62.1和68.14 μg/mL)的抑制作用，并證明其與高含量的總酚和總黃酮有關。抑制活性的不同可能與提取物是否消化或抑酶活性的測量條件不同有關。研究結果表明，體外消化后藜麥酚類物質釋放量增加，對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性更接近真實水平，尤其是透析袋中TPC和TFC的利用率適中，IC50值較低。因此，藜麥有潛力作為替代的功能食品，延緩膳食中碳水化合物的吸收，從而抑制餐后血糖水平的升高。

3 結論

本實驗利用體外模擬消化研究藜麥消化前后多酚、黃酮的變化情況及其抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的變化，結果表明，3種藜麥在消化前后均具有抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的能力。消化前，青海藜麥、山西藜麥總多酚、總黃酮及抗氧化能力均優(yōu)于進口的玻利維亞藜麥。模擬消化后，3種藜麥的總酚和總黃酮含量顯著增加，生物利用率提高，DPPH、ABTS、FRAP方法測得的抗氧化活性有相似的變化趨勢且抗氧化活性都顯著增強，對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用也顯著增強，后續(xù)可研究藜麥有效成分的具體組成及利用動物模型進一步驗證藜麥對血糖的調節(jié)能力。