條斑紫菜Tubulin和Kinesin基因家族鑒定及失水脅迫表達(dá)模式分析*

崔正彩 孔凡娜茅云翔, 2 孫 斌 王俊皓 董道英

條斑紫菜和基因家族鑒定及失水脅迫表達(dá)模式分析*

崔正彩1孔凡娜1①茅云翔1, 2孫 斌1王俊皓1董道英1

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266003; 2. 海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院 熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 三亞 572022)

微管是細(xì)胞骨架的主要成分, 其結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)機(jī)制對(duì)提高生物體耐受性具有重要作用。微管網(wǎng)絡(luò)如何通過結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化調(diào)控適應(yīng)環(huán)境變化已成為脅迫生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。條斑紫菜()能夠適應(yīng)潮間帶復(fù)雜多變的環(huán)境, 是研究潮間帶大型海藻抗逆機(jī)制的良好材料。目前對(duì)紫菜微管相關(guān)基因家族構(gòu)成及其生物學(xué)功能的研究較少。本研究利用生物信息學(xué)方法, 在條斑紫菜基因組中共鑒定出4個(gè)基因(、、和)和11個(gè)基因(—), 并對(duì)其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白特征、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化和失水脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示: 條斑紫菜中有3種微管蛋白(Tubulin)亞型; 該家族成員散布于1號(hào)和2號(hào)染色體上,和為串聯(lián)重復(fù)基因;家族成員在基因結(jié)構(gòu)和蛋白特征方面均較為保守, 且在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)失水脅迫不敏感。條斑紫菜中有5種驅(qū)動(dòng)蛋白(Kinesin)亞型, 亞家族種類和基因數(shù)量均少于高等植物; 該家族基因散布于1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)染色體上, 無串聯(lián)重復(fù)基因;家族成員在基因結(jié)構(gòu)和蛋白特征方面存在一定差異,在中高度失水脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)。本研究為進(jìn)一步理解和基因家族的進(jìn)化和功能、解析微管在條斑紫菜響應(yīng)失水脅迫中的作用奠定了基礎(chǔ)。

條斑紫菜;;; 基因家族; 失水脅迫

微管作為細(xì)胞骨架的重要組成部分, 是多種非生物脅迫的感受器, 在植物抗逆性中發(fā)揮重要作用(Krasylenko, 2012), 微管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的排列影響著微管對(duì)環(huán)境信號(hào)的敏感性(Mirabet, 2018)。微管響應(yīng)環(huán)境信號(hào)變化方式包括介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞壁纖維絲的組裝以及調(diào)節(jié)自身結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)重排等多種生物學(xué)過程(Oakley, 1999; 陳志玲等, 2003; Paradez, 2006; Mineyuki, 2007)。α-和β-tubulin是構(gòu)成微管蛋白亞基的基本結(jié)構(gòu)成分(Nogales, 1998), 其構(gòu)象變化能夠調(diào)節(jié)微管的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性(Shaw, 2003), 使微管骨架通過不斷重構(gòu)響應(yīng)各種生物和非生物刺激(王朝鳳等, 2019), 對(duì)微管發(fā)揮生物學(xué)功能具有重要意義。驅(qū)動(dòng)蛋白Kinesin是沿微管軌道進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力蛋白超家族(Lee, 2004), 具有保守的微管結(jié)合位點(diǎn)和運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域(Reddy, 2001)。Kinesin家族蛋白不僅能夠通過調(diào)節(jié)微管結(jié)合蛋白的運(yùn)輸參與微管結(jié)構(gòu)的調(diào)控, 還能夠直接結(jié)合在微管末端促進(jìn)微管的解聚(周浩等, 2014), 對(duì)微管的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)重排都具有十分重要的作用。

植物微管通過微管蛋白及其相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)參與多種生物學(xué)過程從而適應(yīng)環(huán)境脅迫。擬南芥通過磷脂酶調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性以實(shí)現(xiàn)對(duì)其耐熱性的負(fù)調(diào)控(Zhang, 2017), 通過微管相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)皮脂微管的重組以提高其耐鹽性(Zhou, 2017)。玉米微管通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)膨壓以增強(qiáng)對(duì)干旱環(huán)境的耐受性(Baskin, 1999); 楊樹葉片通過微管結(jié)構(gòu)的變化調(diào)節(jié)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉以減少干旱條件下的水分流失(Swamy, 2015); 仙鶴蘚()通過葉片微管重排以迅速對(duì)失水脅迫做出響應(yīng)(陳志玲等, 2003); 石南星綠藻()的基因在轉(zhuǎn)錄水平顯著響應(yīng)于失水脅迫(Gasulla, 2013); 擬南芥(-基因缺失突變體在干旱條件下比野生型更早出現(xiàn)萎蔫死亡現(xiàn)象(魏麗勤, 2005)。

條斑紫菜生長(zhǎng)于潮間帶地區(qū), 受潮汐影響, 潮間帶地區(qū)海水周期性漲落, 條斑紫菜每天都要經(jīng)歷干濕度、溫度以及滲透壓等各種環(huán)境因子的急劇變化, 是研究潮間帶大型海藻非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制的理想模式生物。目前對(duì)潮間帶海藻細(xì)胞骨架在其適應(yīng)潮間帶環(huán)境中的作用機(jī)制研究甚少。本研究首次在全基因組水平分析了條斑紫菜微管相關(guān)基因和基因家族的組成及其特點(diǎn), 并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探究了葉狀體中表達(dá)豐度高的3個(gè)和2個(gè)在失水脅迫處理下的表達(dá)模式, 為探究微管在條斑紫菜響應(yīng)失水脅迫中的作用奠定基礎(chǔ), 也為進(jìn)一步解析條斑紫菜響應(yīng)逆境脅迫的調(diào)控機(jī)制提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 條斑紫菜() RZ純系, 從海洋生物遺傳與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室紫菜種質(zhì)庫獲取。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RNA提取試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA); DNA酶(購(gòu)自O(shè)MEGA); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自TAKARA); 瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自全式金); 快速質(zhì)粒小提試劑盒(購(gòu)自天根); 2×Taq Plus Master Mix (購(gòu)自南京諾唯贊); ChamQTM SYBR Color qPCR Master Mix (購(gòu)自南京諾唯贊)。

1.2 方法

1.2.1 基因家族鑒定 本研究采用隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model, HMM)對(duì)條斑紫菜和基因家族進(jìn)行鑒定: 從Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載和家族保守結(jié)構(gòu)域HMM模型(PF00022), 通過hmmsearch檢索條斑紫菜Tubulin和Kinesin蛋白種子序列, E-value設(shè)置為1×e-20; 根據(jù)提取的蛋白種子序列構(gòu)建條斑紫菜特異性HMM模型, 利用所構(gòu)建模型通過hmmsearch再次檢索并提取條斑紫菜Tubulin和Kinesin蛋白序列, 設(shè)置E-value<0.01; 將提取到的蛋白序列去重復(fù)后, 根據(jù)蛋白ID號(hào)提取對(duì)應(yīng)基因序列, 獲得和基因家族序列信息。通過軟件SnapGene分析蛋白等電點(diǎn)(pI)和分子量(Mw), 通過在線網(wǎng)站Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)及蛋白序列分析 為探究和家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白序列特征, 本研究對(duì)基因內(nèi)含子-外顯子分布、蛋白保守基序和蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。根據(jù)和家族基因組信息和轉(zhuǎn)錄本ID進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)注釋, 從Gff注釋文件中獲得基因位置信息, 通過網(wǎng)站GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析內(nèi)含子-外顯子分布。通過在線網(wǎng)站MEME (http://meme-suite. org/index.html)預(yù)測(cè)蛋白保守基序, 分布模型選擇anr, 預(yù)測(cè)數(shù)量設(shè)置為10, 最短motif設(shè)置為6 aa, 最長(zhǎng)motif設(shè)置為50 aa。將蛋白序列提交至在線網(wǎng)站SMART(http://smart.embl.de/)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域, 預(yù)測(cè)模型為Normal。

1.2.3 染色體定位及基因復(fù)制分析 本研究通過SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/)分析獲得條斑紫菜的染色體長(zhǎng)度信息, 根據(jù)和基因ID在Gff文件中提取相應(yīng)的基因位置信息, 將提取到的染色體長(zhǎng)度信息和基因位置信息提交至網(wǎng)站MapGene2 Chrom (http://mg2c.iask.in/ mg2c_v2.1/), 繪制基因在染色體上的分布圖。為探究2個(gè)家族中基因復(fù)制情況, 本研究以兩條序列一致度>75%, 比對(duì)區(qū)域序列長(zhǎng)度>較長(zhǎng)序列的75%, 基因距離<100 kb為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)基因篩選, 通過ClustalW比對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因的CDS序列, 根據(jù)輸出文件計(jì)算得到串聯(lián)重復(fù)基因的非同義替換率/同義替換率(Ka/Ks)值, 并分析串聯(lián)重復(fù)基因的進(jìn)化模式。

1.2.4 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析 系統(tǒng)進(jìn)化分析所用臍形紫菜()、紫球藻()、角叉菜()、萊茵衣藻()、團(tuán)藻()、長(zhǎng)囊水云()、擬南芥()以及水稻() 蛋白序列均下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/), 條斑紫菜()和壇紫菜()相關(guān)序列均來自本實(shí)驗(yàn)室通過二代測(cè)序和三代測(cè)序獲得的高質(zhì)量基因組。利用本研究中基因家族鑒定方法, 從NCBI下載的蛋白序列信息中提取各物種和家族成員蛋白序列, 利用ClustalW對(duì)提取的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì), 使用Mega7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 建樹方法為最大似然法(Maximum Likelihood), 建樹模型為泊松模型(Poisson Model), 迭代1000次。

1.2.5 失水脅迫材料處理 參考Kim等人(2009)對(duì)紫菜葉狀體失水的處理方法, 挑選同批培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)良好且日齡為45 d的條斑紫菜葉狀體進(jìn)行不同程度失水脅迫處理, 處理?xiàng)l件分別設(shè)置為失水10%、30%、50%、60%、70%、80%, 失水50%后復(fù)水30 min, 失水80%后復(fù)水30 min和失水80%后復(fù)水60 min, 每組設(shè)置三個(gè)生物學(xué)平行。將藻體置于(10±1) °C培養(yǎng)箱中恒溫失水, 光照為35—45 μmol photons/(m2·s), 樣品失水過程需將藻體平整展開以保證失水均勻, 通過二氧化硅促進(jìn)失水以縮短中高度失水處理組的失水時(shí)間, 將失水時(shí)間控制在0.5 h以內(nèi)。藻體失水率按公式(1)計(jì)算, 其中藻體鮮重為處理前去除藻體表面殘留的水分后測(cè)得的重量, 藻體干重為60 °C下將新鮮藻體烘干至藻體重量不再變化時(shí)測(cè)得的重量。

式中, WL: 藻體失水率; FW: 藻體鮮重; TW: 失水后藻體重量; DW: 藻體干重。

1.2.6 基因表達(dá)水平檢測(cè) 通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 選取在條斑紫菜葉狀體中表達(dá)豐度較高的、、、和, 探究和在不同失水脅迫下的表達(dá)模式。以未經(jīng)失水處理的條斑紫菜RZ純系葉狀體為對(duì)照組, 不同失水和復(fù)水條件處理的條斑紫菜RZ葉狀體為實(shí)驗(yàn)組, 每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)平行和3個(gè)技術(shù)重復(fù), 通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因在不同程度失水脅迫下的表達(dá)變化, 引物序列如表1所示。內(nèi)參基因?yàn)椴煌畻l件下在條斑紫菜中表達(dá)穩(wěn)定的基因(Gao, 2018), 在內(nèi)參基因的矯正下, 用2-DDCt法計(jì)算得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量, 并通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS (Statistical Product and Service Solutions)對(duì)不同失水脅迫條件下基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn), 置信區(qū)間百分比為95%。

表1 qRT-PCR所用引物序列

Tab.1 Primer sequences used in qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 基因家族的鑒定

經(jīng)過hmmsearch檢索和比對(duì)篩選, 最終確定條斑紫菜基因組中基因家族有4個(gè)成員, 均含有家族保守結(jié)構(gòu)域, 分別命名為、、和。cDNA序列最短為1377 bp, 最長(zhǎng)為2529 bp, 編碼多肽的氨基酸數(shù)量為454—465, 分子量從49.51— 51.42 kDa, 等電點(diǎn)從4.33到4.97不等。對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè), 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Pyα-tubulin 1和Pyα-tubulin 2定位于線粒體, Pyβ-tubulin和Pyγ-tubulin定位于細(xì)胞質(zhì)。條斑紫菜家族共鑒定出11個(gè)成員, 均含有驅(qū)動(dòng)蛋白保守運(yùn)動(dòng)域, 將11個(gè)分別命名為—, cDNA序列最短為1272 bp, 最長(zhǎng)為4101 bp, 編碼多肽的氨基酸數(shù)量為423—1366, 分子量從41.91—128.26 kDa, 等電點(diǎn)從4.79到10.96不等。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示有8個(gè)蛋白定位于細(xì)胞核, 3個(gè)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。和基因家族蛋白特征如表2所示。

2.2 基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析

條斑紫菜家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明,基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 4個(gè)基因均不含內(nèi)含子(圖1a); 蛋白保守基序相似性較高, 所有家族成員均包含motif1-motif 8,缺少motif 9和motif 10,缺少motif 10 (圖1b); 蛋白結(jié)構(gòu)域保守, 4個(gè)Py-tubulin蛋白氨基端均包含一個(gè)保守的Tubulin蛋白GTP酶結(jié)構(gòu)域, 羧基端均含有一個(gè)保守的Tubulin羧基端結(jié)構(gòu)域(圖1c)。

表2 條斑紫菜和基因家族蛋白特征

Tab.2 Protein characteristics of Tubulin and Kinesin gene family in P. yezoensis

圖1 PyTubulin基因家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域

注: a:家族內(nèi)含子-外顯子分布; b:家族motif(基序)分布; c:家族蛋白結(jié)構(gòu)域分布; d:家族motif(基序)序列信息

條斑紫菜家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明,基因結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單, 其中、、和均含有1個(gè)內(nèi)含子, 其余7個(gè)基因均不含內(nèi)含子(圖2a); 不同蛋白保守基序的數(shù)量和分布差異較大, 同一蛋白中某一特定motif重復(fù)出現(xiàn)頻率高, 如motif 5在PyKinesin 3中出現(xiàn)了10次, 在PyKinesin 10中沒有出現(xiàn), motif 9在PyKinesin 8中連續(xù)出現(xiàn)8次(圖2b); 蛋白結(jié)構(gòu)域保守, 11個(gè)蛋白均含有典型的驅(qū)動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)域, 其中有6個(gè)Py-Kinesin的運(yùn)動(dòng)域在氨基端, 3個(gè)Py-Kinesin的運(yùn)動(dòng)域在羧基端, 另外2個(gè)Py-Kinesin的運(yùn)動(dòng)域位于蛋白序列的中間位置(圖2c)。

圖2 PyKinesin基因家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域

注: a:家族內(nèi)含子-外顯子分布; b:家族motif(基序)分布; c:家族蛋白結(jié)構(gòu)域分布; d:家族motif(基序)序列信息

2.3 染色體定位與基因復(fù)制分析

基因家族染色體定位分析結(jié)果表明、和均定位于2號(hào)染色體,定位于1號(hào)染色體(圖3)?；驈?fù)制分析結(jié)果表明和為串聯(lián)重復(fù)基因, 其非同義替換率Ka=0.0166, 同義替換率Ks=0.8126, Ka/Ks= 0.0204。根據(jù)Ka/Ks值估算串聯(lián)重復(fù)基因的進(jìn)化選擇模式, Ka/Ks=1表示中性選擇, Ka/Ks<1表示純化選擇, Ka/Ks>1表示正選擇(李曉翠等, 2020), 故和的進(jìn)化選擇模式為純化選擇。

圖3 PyTubulin基因家族染色體定位

注: PY-1: 條斑紫菜1號(hào)染色體; PY-2: 條斑紫菜2號(hào)染色體

家族染色體定位結(jié)果顯示,、、和分布于1號(hào)染色體,、、、和分布于2號(hào)染色體,位于3號(hào)染色體(圖4)。由于基因組Gff文件中缺少注釋信息, 無法定位?；驈?fù)制分析結(jié)果表明基因家族沒有串聯(lián)重復(fù)基因。

圖4 PyKinesin基因家族染色體定位

注: PY-1: 條斑紫菜1號(hào)染色體; PY-2: 條斑紫菜2號(hào)染色體; PY-3: 條斑紫菜3號(hào)染色體

2.4 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)來自條斑紫菜(Py)、壇紫菜(Ph)、臍形紫菜(Pu)、紫球藻(Pp)、角叉菜(Cc)、萊茵衣藻(Cr)、團(tuán)藻(Vc)、長(zhǎng)囊水云(Es)、擬南芥(At)以及水稻(Os)的72條Tubulin蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果表明, 10個(gè)物種的Tubulin蛋白均包含α-tubulin、β-tubulin和γ-tubulin 3大亞家族, 在萊茵衣藻和團(tuán)藻兩種綠藻中還存在δ-tubulin、ε-tubulin和η-tubulin 3種微管蛋白亞型。在α-tubulin、β-tubulin和γ-tubulin 3大亞家族分支中, 紅藻、褐藻和綠色植物的Tubulin分別形成了獨(dú)立的姐妹枝, 條斑紫菜的Tubulin基因均與其他4種紅藻的Tubulin聚在一起, 萊茵衣藻和團(tuán)藻兩種綠藻與擬南芥和水稻的Tubulin聚在一簇, 長(zhǎng)囊水云單獨(dú)成一簇。

圖5 PyTubulin基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)條斑紫菜(Py)、壇紫菜(Ph)、臍形紫菜(Pu)、角叉菜(Cc)、萊茵衣藻(Cr)、團(tuán)藻(Vc)、長(zhǎng)囊水云(Es)以及擬南芥(At)家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示(圖6), 152個(gè)Kinesin家族蛋白共分為11個(gè)Group, 其中Group Ⅰ和Group Ⅺ為藻類中特有的亞型。紅藻分布于其中6個(gè)Group, 擬南芥和綠藻均分布于其中9個(gè)Group, 褐藻長(zhǎng)囊水云在11個(gè)Group中均有分布。PyKinesin家族的11個(gè)蛋白分布在其中5個(gè)Group中, PyKinesin4單獨(dú)聚在Group Ⅱ的一個(gè)分支中, 其余10個(gè)PyKinesin均和其他紅藻Kinesin聚在一起。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明, 4個(gè)紅藻的基因亞家族種類和基因數(shù)量均明顯少于高等植物和其他藻類, 這可能是由于家族在進(jìn)化過程中發(fā)生了基因家族擴(kuò)張。

2.5 基因表達(dá)水平檢測(cè)

選取條斑紫菜葉狀體中表達(dá)豐度高的和作為目的基因, 利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)分析5個(gè)基因在不同失水和復(fù)水條件下的轉(zhuǎn)錄變化, 檢測(cè)結(jié)果如圖7—10所示。和基因在不同失水和復(fù)水條件下表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式,但表達(dá)量變化均不顯著, 對(duì)失水脅迫沒有明顯的響應(yīng)。2個(gè)基因?qū)κ{迫呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式,對(duì)失水脅迫敏感, 其表達(dá)量隨著失水程度的增加顯著上調(diào), 在失水50%、60%、70%以及80%時(shí)達(dá)到對(duì)照組的2倍以上, 復(fù)水后表達(dá)量下調(diào), 在失水80%復(fù)水60 min后下調(diào)顯著,在不同失水和復(fù)水脅迫下表達(dá)量均無顯著變化。

圖6 PyKinesin基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖7 不同失水條件下PyTubulin基因表達(dá)量

注: 10%: 失水10%處理組; 30%: 失水30%處理組; 50%: 失水50%處理組; 60%: 失水60%處理組; 70%: 失水70%處理組; 80%: 失水80%處理組; 相對(duì)表達(dá)量=表達(dá)量平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3)

圖8 不同復(fù)水條件下PyTubulin基因表達(dá)量

注: a: 失水50%復(fù)水組; b: 失水80%復(fù)水組; 50%: 失水50%處理組; 80%: 失水80%處理組; 50%-30 min: 失水50%后復(fù)水30 min處理組; 80%-30 min: 失水80%后復(fù)水30 min處理組; 80%-60 min: 失水80%后復(fù)水60 min處理組; 相對(duì)表達(dá)量=表達(dá)量平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3)

圖9 不同失水條件下PyKinesin基因表達(dá)量

注: 10%: 失水10%處理組; 30%: 失水30%處理組; 50%: 失水50%處理組; 60%: 失水60%處理組; 70%: 失水70%處理組; 80%: 失水80%處理組; 相對(duì)表達(dá)量=表達(dá)量平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3); **:<0.01

圖10 不同復(fù)水條件下PyKinesin基因表達(dá)量

注: a: 失水50%復(fù)水組; b: 失水80%復(fù)水組; 50%: 失水50%處理組; 50%-30 min: 失水50%后復(fù)水30 min處理組; 80%: 失水80%處理組; 80%-30 min: 失水80%后復(fù)水30 min處理組; 80%-60 min: 失水80%后復(fù)水60 min處理組; 相對(duì)表達(dá)量=表達(dá)量平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=3); **:<0.01

3 討論

微管是細(xì)胞骨架的重要組成部分, 目前在真核生物中共鑒定出7種微管蛋白, 分別是α、γ、β、δ、ε、ζ 和 η 微管蛋白, α、β、γ微管蛋白基因存在于所有真核生物中, 是微管聚合的必需基因, δ、ε、ζ和η微管蛋白基因只在少數(shù)真核生物中存在(Dutcher, 2001)。在高等植物中通常有多個(gè)/-基因, 棉花中至少有13個(gè), 水稻中至少有8個(gè)(Radchuk, 2008), 而白楊中至少存在20個(gè)(Oakley, 2007)。本研究發(fā)現(xiàn), 所分析的5種紅藻中只有α、β和 γ 3種微管蛋白基因, 其中條斑紫菜中含有2個(gè)、1個(gè)和1個(gè), 基因數(shù)量明顯少于高等植物。萊茵衣藻和團(tuán)藻兩種綠藻中除了α、β和γ三種微管蛋白外, 還存在、和。高等植物擬南芥基因組擁有61種驅(qū)動(dòng)蛋白的編碼基因, 是植物基因組中最大的驅(qū)動(dòng)蛋白庫, 硅藻中有25種驅(qū)動(dòng)蛋白, 與綠藻驅(qū)動(dòng)蛋白的數(shù)量相近, 而紅藻驅(qū)動(dòng)蛋白()種類明顯少于高等植物和其他藻類,中只有5種驅(qū)動(dòng)蛋白(Richardson, 2006), 臍形紫菜只鑒定出4種驅(qū)動(dòng)蛋白(Brawley, 2017), 本研究在條斑紫菜中鑒定出了11個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白基因, 分為5個(gè)亞家族。條斑紫菜隸屬于紅藻門, 后者作為一種古老的物種, 其微管及其相關(guān)蛋白家族成員數(shù)量之少, 可能與其在進(jìn)化過程中缺乏薄壁組織且無法形成復(fù)雜的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)(Brawley, 2017)。

高等植物基因中通常含有多個(gè)內(nèi)含子, 擬南芥中包含4個(gè)內(nèi)含子(Ludwig, 1988), 毛白楊基因中也均包含3—4個(gè)內(nèi)含子(饒國(guó)棟等, 2015), 而條斑紫菜家族基因結(jié)構(gòu)比高等植物簡(jiǎn)單, 4個(gè)均不含內(nèi)含子。衣藻和被子植物所有的驅(qū)動(dòng)蛋白()都含有內(nèi)含子, 而紅藻驅(qū)動(dòng)蛋白普遍缺乏內(nèi)含子, 條斑紫菜驅(qū)動(dòng)蛋白大多不含內(nèi)含子, 少數(shù)驅(qū)動(dòng)蛋白基因只有1個(gè)內(nèi)含子, 這與其他紅藻驅(qū)動(dòng)蛋白內(nèi)含子的數(shù)量相近, 也支持了紅藻基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了內(nèi)含子丟失這一觀點(diǎn)(Hoef, 2005)。

微管骨架是植物細(xì)胞響應(yīng)脅迫信號(hào)的傳感器, 脅迫會(huì)引起微管骨架的解體和重新聚合(Ma, 2019), 但不同物種中微管結(jié)構(gòu)對(duì)失水脅迫的響應(yīng)方式不同。玉米微管在失水脅迫下參與調(diào)控氣孔形態(tài)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu), 并通過控制纖維素微纖絲的形成來調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的形成和膨壓以增強(qiáng)對(duì)干旱的耐受性(Baskin, 1999), 而細(xì)胞膨壓與微管的排列方向有關(guān), 螺旋藻微管隨著膨壓的升高從縱向/斜向排列向橫向排列轉(zhuǎn)換(Iwata, 2001)。仙鶴蘚()微管骨架在失水脅迫影響下從有規(guī)律排列的細(xì)絲狀重排為無規(guī)律排列的較粗的微管束(陳志玲等, 2003)。油菜幼苗細(xì)胞的快速失水會(huì)導(dǎo)致微管的解聚, 但在低失水脅迫壓力下, 微管結(jié)構(gòu)并沒有明顯的變化(Bagniewska-Zadworna, 2008)。研究也發(fā)現(xiàn), 失水脅迫下基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量也呈現(xiàn)顯著變化, 如石南星綠藻() 2個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在失水脅迫后期顯著積累(Gasulla, 2013), 表明基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累與微管骨架形態(tài)的變化及結(jié)構(gòu)的重排有密切關(guān)聯(lián)。驅(qū)動(dòng)蛋白(Kinesin)利用ATP水解釋放的能量沿微管運(yùn)動(dòng), 具有保守的運(yùn)動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)域, 能夠牽動(dòng)分子貨物沿著微管作長(zhǎng)距離運(yùn)輸(陳珊珊, 2019), 直接參與到細(xì)胞骨架在多種生物過程中的排列調(diào)節(jié)。

項(xiàng)目組前期轉(zhuǎn)錄組研究表明, 條斑紫菜的和家族在葉狀體和絲狀體中的表達(dá)具有顯著的世代特異性。本研究進(jìn)一步采用qRT-PCR方法檢測(cè)了在葉狀體中高表達(dá)的、和在失水脅迫下的表達(dá)模式, 結(jié)果顯示, 不同成員在失水、復(fù)水脅迫下的表達(dá)模式不同。、和三個(gè)基因在不同失水脅迫條件下表達(dá)量雖出現(xiàn)浮動(dòng), 但并無顯著變化, 在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)失水脅迫響應(yīng)不顯著, 與之前轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),在不同失水和復(fù)水條件下表達(dá)豐度變化不顯著, 因此推測(cè)該基因在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)失水脅迫也不敏感。在中高度失水條件下表達(dá)量顯著上調(diào), 在復(fù)水后表達(dá)水平又迅速降低,在失水脅迫下表達(dá)量沒有顯著變化。轉(zhuǎn)錄組分析表明,在高度失水時(shí)表達(dá)豐度顯著增加, 復(fù)水后表達(dá)豐度降低,在不同失水和復(fù)水條件下表達(dá)豐度變化不顯著, 與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),家族其余基因在失水和復(fù)水過程中表達(dá)豐度均較低, 且沒有發(fā)生顯著變化, 推測(cè)該家族其余基因在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)失水脅迫不敏感。對(duì)基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)屬于家族, 有研究表明,家族成員具有解聚酶催化活性, 能夠結(jié)合在微管末端促進(jìn)微管的解聚, 在細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞分離以及細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)等過程均發(fā)揮了重要作用(周浩等, 2014)。據(jù)此推測(cè),在條斑紫菜細(xì)胞響應(yīng)失水脅迫時(shí), 可能在微管結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用, 但該基因在微管結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中如何發(fā)揮作用還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定了條斑紫菜和基因家族, 解析了和家族成員的組成、基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)和進(jìn)化特點(diǎn), 探究了在葉狀體中高表達(dá)的和基因家族成員在不同失水脅迫條件下的表達(dá)變化, 為進(jìn)一步了解微管相關(guān)基因在條斑紫菜響應(yīng)失水脅迫中的作用奠定了基礎(chǔ)。

王朝鳳, 孔照勝, 2019. 植物細(xì)胞微管研究進(jìn)展. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 41(3): 372—380

李曉翠, 康凱程, 黃先忠等, 2020. 小擬南芥MKK基因家族全基因組鑒定及進(jìn)化和表達(dá)分析. 遺傳, 42(4): 403—421

陳志玲, 歐陽浩淼, 劉祥林等, 2003. 微管骨架在苔蘚植物適應(yīng)干旱脅迫應(yīng)答中的功能研究. 生物工程學(xué)報(bào), 19(3): 317—321

陳珊珊, 2019. 番茄表皮毛形態(tài)和內(nèi)部細(xì)胞骨架排布的研究. 杭州: 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文

周 浩, 沈 濤, 2014. 微管解聚酶驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員KIF2A研究進(jìn)展. 生命科學(xué), 26(8): 866—873

饒國(guó)棟, 睢金凱, 張建國(guó), 2015. 毛白楊α-微管蛋白基因家族的克隆與序列分析. 林業(yè)科學(xué)研究, 28(1): 44—49

魏麗勤, 2005. 動(dòng)蛋白Kinesin-13A和類錨蛋白AtANK1在植物細(xì)胞中的分布及功能. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文

Bagniewska-Zadworna A, 2008. The root microtubule cytoskeleton and cell cycle analysis through desiccation ofseedlings. Protoplasma, 233(3—4): 177—185

Baskin T I, Meekes H T H N, Liang B M, 1999. Regulation of growth anisotropy in well-watered and water-stressed maize roots. II. Role of cortical microtubules and cellulose microfibrils. Plant Physiology, 119(2): 681—692

Brawley S H, Blouin N A, Ficko-Blean E, 2017. Insights into the red algae and eukaryotic evolution from the genome of(Bangiophyceae, Rhodophyta). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 114(31): E6361—E6370

Dutcher S K, 2001. The tubulin fraternity: alpha to eta. Current Opinion in Cell Biology, 13(1): 49—54

Gao D, Kong F N, Sun P P, 2018. Transcriptome-wide identification of optimal reference genes for expression analysis ofresponses to abiotic stress. BMC Genomics, 19(1): 251

Gasulla F, Jain R, Barreno E, 2013. The response of(Ahmadjian) Skaloud et Peksa to desiccation: a proteomic approach. Plant, Cell & Environment, 36(7): 1363—1378

Hoef E K, Shrestha R P, Lapidot M, 2005. Actin phylogeny and intron distribution in bangiophyte red algae (rhodoplantae). Journal of Molecular Evolution, 61(3): 360—371

Iwata K, Tazawa M, Itoh T, 2001. Turgor pressure regulation and the orientation of cortical microtubules incells. Plant and Cell Physiology, 42(6): 594—598

Kim J K, Kraemer G P, Yarish C, 2009. Research note: comparison of growth and nitrate uptake by New Englandspecies from different tidal elevations in relation to desiccation. Phycological Research, 57(2): 152—157

Krasylenko Y A, Yemets A I, Blume Y B, 2012. Cytoskeleton- mediated signalling pathways in UV-B perception by plant cell. Emirates Journal of Food and Agriculture, 24(6): 557—564

Lee Y R J, Liu B, 2004. Cytoskeletal motors in Arabidopsis. Sixty-one kinesins and seventeen myosins. Plant Physiology, 136(4): 3877—3883

Ludwig S R, Oppenheimer D G, Silflow C D, 1988. The α1-tubulin gene of: primary structure and preferential expression in flowers. Plant Molecular Biology, 10(4): 311—321

Ma H X, Liu M, 2019. The microtubule cytoskeleton acts as a sensor for stress response signaling in plants. Molecular Biology Reports, 46(5): 5603—5608

Mineyuki Y, 2007. Plant microtubule studies: past and present. Journal of Plant Research, 120(1): 45—51

Mirabet V, Krupinski P, Hamant O, 2018. The self-organization of plant microtubules inside the cell volume yields their cortical localization, stable alignment, and sensitivity to external cues. PLoS Computational Biology, 14(2): e1006011

Nogales E, Wolf S G, Downing K H, 1998. Structure of the αβ tubulin dimer by electron crystallography. Nature, 391(6663): 199—203

Oakley B R, 1999. γ-Tubulin. Current Topics in Developmental Biology, 49: 27—54

Oakley R V, Wang Y S, Ramakrishna W, 2007. Differential expansion and expression of- and-tubulin gene families in. Plant Physiology, 145(3): 961—973

Paradez A, Wright A, Ehrhardt D W, 2006. Microtubule cortical array organization and plant cell morphogenesis. Current Opinion in Plant Biology, 9(6): 571—578

Radchuk V V, 2008. The transcriptome of the tubulin gene family in plants.: Blume, Y B, Baird, W V eds. The Plant Cytoskeleton: A Key Tool For Agro-biotechnology. New York, NY: Springer Dordrecht, 219—241

Reddy A S N, 2001. Molecular motors and their functions in plants. International Review of Cytology, 204: 97—178

Richardson D N, Simmons M P, Reddy A S, 2006. Comprehensive comparative analysis of kinesins in photosynthetic eukaryotes. BMC Genomics, 7: 18

Shaw S L, Kamyar R, Ehrhardt D W, 2003. Sustained microtubule treadmilling incortical arrays. Science, 300(5626): 1715—1718

Swamy P S, Hu H, Pattathil S, 2015. Tubulin perturbation leads to unexpected cell wall modifications and affects stomatal behaviour in. Journal of Experimental Botany, 66(20): 6507—6518

Zhang Q, Song P, Qu Y N, 2017. Phospholipase Dδ negatively regulates plant thermotolerance by destabilizing cortical microtubules inPlant, Cell & Environment, 40(10): 2220—2235

Zhou S, Chen Q H, Li X Y, 2017. MAP65-1 is required for the depolymerization and reorganization of cortical microtubules in the response to salt stress in. Plant Science, 264: 112—121

IDENTIFICATION AND EXPRESSION PATTERN ANALYSIS OFANDGENE FAMILY INTO DEHYDRATION STRESSES

CUI Zheng-Cai1, KONG Fan-Na1, MAO Yun-Xiang1, 2, SUN Bin1, WANG Jun-Hao1, DONG Dao-Ying1

(1. The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Key Laboratory of Utilization and Conservation of Tropical Marine Bioresource (Ministry of Education), College of Fisheries and Life Science, Hainan Tropical Ocean University, Sanya 572022, China)

Microtubules, the main components of the cytoskeleton, play vital important roles in improving the tolerance of organisms by altering their structures in dynamic mechanisms; and they have become one of the research hotspots in the field of stress biology.is an ideal candidate macroalgae for the investigation of the mechanism of stress resistance because of its fast-changing living conditions in intertidal zone. At present, few studies reported the compositions and biological functions of microtubule-related gene families of. In this study, we identified fourgenes (,,,and) and 11genes (—) ingenomeusing bioinformatics methods. The physicochemical properties, gene structures, protein characteristics, chromosomal locations, phylogenetic evolution, and expression patterns of the two gene families inunder dehydration stress were systematically analyzed. The results show that fourgenes could be divided into three subclusters ofgene families and they were scattered on chromosome 1 and chromosome 2 of.andwere tandem repeat genes. Thefamily was conserved in gene and protein structures and insensitive to dehydration stress in transcription level. Five subclusters ofgene families were identified among the 11genes in, which was less than that of higher plants.were scattered on all the three chromosomes ofand there were no tandem repeat genes. Thefamilies had certain differences in gene and protein structures. The expression ofwas significantly enhanced under the medium and high dehydration stress. This study shall laid foundation for further analysis of microtubules in respond to dehydration stress of.

;;; gene family; dehydration stress

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 41976146號(hào), 31672641號(hào)。崔正彩, 碩士研究生, E-mail:17860723190@163.com

孔凡娜, 副教授, E-mail: fnkong@ouc.edu.cn

2020-06-21,

2020-07-19

S917.3

10.11693/hyhz20200600174