基于磁固相萃取和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的日本醫(yī)蛭抗凝活性成分研究*

黃小清，汪波，肖凌，聶晶

(1.武漢大學(xué)藥學(xué)院組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430071；2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

日本醫(yī)蛭(Hirudonipponica，H.nipponica)是醫(yī)蛭科(Hirudinidae)醫(yī)蛭屬(Hirudo)的一種重要的傳統(tǒng)動(dòng)物藥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》《名醫(yī)別錄》等古醫(yī)學(xué)著作中均有相關(guān)記載[1]，也是2015版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)收錄的三大藥用水蛭品種之一。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為水蛭具有逐瘀破血的功效，國(guó)外也保留著活體水蛭療法用于治療靜脈充血的臨床應(yīng)用[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，日本醫(yī)蛭相比其他兩種蛭類(lèi)品種具有更強(qiáng)的抗凝血活性[3]。水蛭素類(lèi)多肽成分是實(shí)現(xiàn)該功效的重要藥效基礎(chǔ)[1，4]，水蛭素最早提取自醫(yī)蛭科歐洲醫(yī)蛭(Hirudo Medicinalis)的唾液腺，也是現(xiàn)行唯一審批進(jìn)入臨床使用的最強(qiáng)效凝血酶抑制劑以及天然抗凝劑[1，5]。對(duì)日本醫(yī)蛭轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析表明，其唾液腺組織表達(dá)水蛭素類(lèi)抗凝多肽成分[6]。但在日本醫(yī)蛭抗凝成分研究中，以小分子化合物類(lèi)成分報(bào)道居多[7-8]。日本醫(yī)蛭中生物大分子成分復(fù)雜，抗凝活性成分含量低，采用傳統(tǒng)溶劑提取和色譜分離純化的方法，通常需消耗數(shù)千克活體樣品，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力[9-10]，日本醫(yī)蛭抗凝成分的蛋白序列信息缺乏，質(zhì)譜鑒定困難。

磁固相萃取通過(guò)外加磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)成分的快速分離，毫克級(jí)別的粗提物即可完成分離純化，具有簡(jiǎn)便、快捷、耗樣量少的特點(diǎn)[11]，此外，功能化修飾能夠讓磁珠具有指定的物理化學(xué)性質(zhì)，因而在科學(xué)研究[11]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[12]和生物醫(yī)學(xué)[13]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本研究以日本醫(yī)蛭中抗凝活性大分子研究為例，合成凝血酶磁珠并應(yīng)用于日本醫(yī)蛭中抗凝成分的篩選，同時(shí)構(gòu)建日本醫(yī)蛭唾液腺蛋白序列庫(kù)用于抗凝成分的質(zhì)譜驗(yàn)證，以期為日本醫(yī)蛭抗凝生物大分子分離鑒定建立一種新方法。

1 材料與方法

1.1儀器傅立葉變換紅外分光光度計(jì)(Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR，Waltham，美國(guó))，JEM-2010 FEF透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)，NanoPhotometer?分光光度計(jì)(IMPLEN，美國(guó))，Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(Agilent Technologies，美國(guó))，自動(dòng)化液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析系統(tǒng)包括美國(guó)AB SCIEX公司TripleTOF 5600 型LC-MS/MS系統(tǒng)，配有電噴霧電離源以及三重四級(jí)桿飛行時(shí)間(triple quadrupole time-of-flight，TripleTOF)質(zhì)量分析器，ChromXP C18色譜柱(75 μm×150 mm，3 μm，100 A，美國(guó)Eksigent公司)和Zorbax 300SB-C18捕獲柱(5 mm×0.3 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫公司)。

1.2試劑及藥材原硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS，含量>99%，批號(hào)：T110596)，四氧化三鐵磁性納米顆粒(Fe3O4magnetic nanoparticles，MNPs，粒徑20 nm，含量>99%，批號(hào)：I109514)，聚乙烯吡咯烷酮，3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷[(3 glycidyloxypropyl)trimethoxysilane，GLYMO，含量>97%，批號(hào)：G107576)]，凝血酶發(fā)色底物(S2238，HD-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl，批號(hào)：113711-77-6)和牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA，含量≥96%，批號(hào)：A116563)均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；硫酸銨(含量≥99.0%)、乙酸(含量≥99.8%)、乙腈(含量≥99.5%)均由上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；人凝血酶(Sigma-Aldrich公司，西班牙)，纖維蛋白原(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140626-201611)，TRIzol Reagent kit(Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，型號(hào)：15596026)，RNA-seq文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(New England Biolabs，美國(guó)，型號(hào)：E7530S)，AMPure XP beads(核酸分選磁珠，Beckman Coulter，Inc.，批號(hào)：E7490S)，核酸定量分析試劑盒(DNA HS Assay Kit，Agilent Technologies，美國(guó)，批號(hào)：50674626)。新鮮超純水由Milli-Q儀器凈化系統(tǒng)(Millipore，法國(guó))制得。所用試劑均為分析級(jí)或分子級(jí)，除另有說(shuō)明外，本研究所用緩沖溶液均為0.1 mol·L-1、pH值7.4的磷酸鹽(phosphate-buffered saline，PBS)緩沖液。

水蛭從湖北省荊門(mén)市京山縣采集并活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存，樣品經(jīng)湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院中藥檢驗(yàn)研究中心肖凌老師鑒定為醫(yī)蛭科醫(yī)蛭屬日本醫(yī)蛭(Hirudonipponica)。

1.3凝血酶固定化磁珠制備及條件優(yōu)化基于TEOS的水解反應(yīng)制備二氧化硅修飾磁性納米顆粒(SiO2-modified magnetic nanoparticle，SMNPs)[11，14]，隨后對(duì)方法[15]進(jìn)行了適量修改合成環(huán)氧硅烷化磁性納米顆粒(epoxy-coated magnetic nanoparticle，EMNPs)。將MNPs粉末(200 mg)超聲分散在17%聚乙烯吡咯烷酮水混合液中，所得產(chǎn)物繼續(xù)分散在異丙醇/氨/TEOS溶液(體積比18：7：1)520 mL中，連續(xù)機(jī)械攪拌15 h，即得SMNPs。取SMNPs粉末100 mg于50%乙醇50 mL中，超聲30 min，加入 GLYMO 0.4 g，所得懸浮液在氮?dú)?N2)保護(hù)下于50 ℃水浴7 h，產(chǎn)物真空干燥，即得EMNPs。

凝血酶通過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng)固定于EMNPs表面，取EMNPs(10 mg)分散在含有33 U·mL-1凝血酶和1 mol·L-1硫酸銨的 PBS緩沖液1 mL中，37 ℃孵育8 h后收集磁珠，再與0.8%聚山梨酯-20/PBS液混旋1 h，即得凝血酶固定化磁珠。同時(shí)，BSA代替凝血酶進(jìn)行上述固定化反應(yīng)，合成BSA磁珠作為陰性對(duì)照磁珠。

分別對(duì)EMNPs與凝血酶反應(yīng)比例以及PBS緩沖溶液pH值進(jìn)行優(yōu)化。比例優(yōu)化時(shí)，分別將EMNPs2，3，6，9和12 mg與33 U·mL-1凝血酶溶液反應(yīng)，所得磁珠采用酶活性檢測(cè)法測(cè)定磁珠活性。凝血酶與磁珠比例為3.67 U·mg-1時(shí)，所得磁珠的單位凝血酶活性值最大。pH條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用pH 值5，6，7，8和9的PBS緩沖液，結(jié)果顯示pH值為8時(shí)的酶活性值達(dá)到最大值，見(jiàn)圖1。

圖1 凝血酶固定化過(guò)程中的條件優(yōu)化

1.5水蛭唾液腺分離以及轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)制備取出水蛭的唾液腺組織[6]，根據(jù)TRIzol Reagent試劑盒操作說(shuō)明提取組織總RNA，并在NanoPhotometer和Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上進(jìn)行純度和質(zhì)量檢查，選取RIN score >7的RNA，使用poly-T寡鏈磁珠制備mRNA，在評(píng)估m(xù)RNA的數(shù)量和完整性后，參考RNA文庫(kù)制備試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，AMPure XP beads用于純化cDNA片段，片段的大小使用DNA測(cè)定試劑盒在Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)，合格cDNA片段在Illumina HiSeq 6000平臺(tái)上進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度為150 bp。

1.6日本醫(yī)蛭中抗凝成分篩選

1.6.1磁固相萃取及洗脫條件考察將“1.5”項(xiàng)下的唾液腺組織勻漿，5000×g離心10 min，上清液凍干即為L(zhǎng)1樣品。取凝血酶磁珠10 mg于 L1溶液1 mL(50 mg·mL-1，PBS緩沖液配制)中，混旋30 min，混合溶液37 ℃水浴8 h，PBS緩沖液淋洗3次，隨即向磁珠中加入洗脫溶液1 mL，振蕩2 min，所得洗脫上清液即為L(zhǎng)2樣品溶液。采用BSA磁珠同步上述操作，洗脫上清液即為陰性對(duì)照溶液(L3樣品溶液)。

洗脫條件優(yōu)化，分別用30%，50%，70%乙腈/PBS溶液或乙醇/PBS溶液作為洗脫溶液完成上述磁固相萃取過(guò)程，采用文獻(xiàn)[17]報(bào)道的凝血酶滴定法測(cè)定洗脫液的抗凝血酶活性。

洗脫溶劑的條件優(yōu)化結(jié)果表明，以30% 乙腈/PBS溶液作為洗脫溶劑時(shí)，洗脫液凍干粉具有最高的抗凝活性，為70 U·g-1。

1.6.2十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)取L1樣品50 mg溶于 0.1 mol·L-1PBS緩沖液(pH值7.4)1 mL，制得L1樣品溶液，取優(yōu)化條件下洗脫的L2、L3樣品溶液，經(jīng)15% SDS-PAGE凝膠100 V電泳1.5 h，考馬斯亮藍(lán)R-250染色觀察。

1.6.3LC-MS/MS分析將L1、L2樣品分別以預(yù)冷丙酮(4 ℃)沉淀蛋白，沉淀復(fù)溶后，依次加入二硫蘇糖醇(終濃度10 mmol·L-1)、碘乙酰胺(終濃度40 mmol·L-1)完成還原以及烷基化反應(yīng)，隨后以胰蛋白酶與樣本蛋白量1：50比例加入胰蛋白酶進(jìn)行酶切，反應(yīng)完成后12 000×g離心15 min，上清液脫鹽濃縮即得質(zhì)譜分析樣品[18]。

LC-MS分析時(shí)，樣品經(jīng)C18捕獲柱純化后，洗脫至C18分析柱分離，流動(dòng)相A：3%二甲亞砜，97%水，0.1%甲酸；流動(dòng)相B：3%二甲亞砜，97%乙腈，0.1%甲酸，100 min分析梯度，流速300 nL·min-1。數(shù)據(jù)采集在Triple TOF 5600系統(tǒng)上進(jìn)行，采用數(shù)據(jù)非依賴(lài)采集模式，MS全掃描的質(zhì)荷比(m/z)范圍為350～1500，離子累積時(shí)間250 ms，選取母離子信號(hào)大于120 cps的40個(gè)離子峰進(jìn)行二級(jí)掃描，子離子m/z范圍100～1500，離子累積時(shí)間50 ms，電荷數(shù)為+2～+5，離子重復(fù)采集的排除時(shí)間為18 s[19]。

1.7數(shù)據(jù)分析運(yùn)用ProteinPilot(V4.5版)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，檢索算法為Paragon，日本醫(yī)蛭唾液腺蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)為質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果以Unused≥1.3為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，過(guò)濾掉蛋白反庫(kù)中檢索到的條目和污染蛋白，余下所有蛋白序列信息在blast2 go(https：//www.blast2 go.com/blast2 go-pro/download-b2 g)上進(jìn)行功能注釋。

2 結(jié)果

2.1功能化磁納米粒的表征及穩(wěn)定性考察凝血酶磁珠通過(guò)3個(gè)連續(xù)步驟合成，并且所得磁珠可通過(guò)外加磁鐵輕易捕獲并收集，保證了磁固相萃取過(guò)程中的磁分離效果。SMNPs、EMNPs、凝血酶磁珠以及固相萃取后的凝血酶磁珠的FT-IR譜圖見(jiàn)圖2。在569.29 和1039.56 cm-1處的尖峰分別為Fe-O和Si-O鍵的伸縮振動(dòng)峰，并且在SMNP和EMNP的3404.54 cm-1處出現(xiàn)了硅烷的O-H伸縮振動(dòng)吸收帶，在圖2的4條譜線(xiàn)中都可觀察到所述吸收峰，表明SMNP的存在。EMNPs的2921.40 和2853.17 cm-1處出現(xiàn)的弱峰是環(huán)氧硅烷的C-H伸縮振動(dòng)造成的，上述紅外吸收現(xiàn)象與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的結(jié)果相符，凝血酶中存在烷基，凝血酶磁珠在2921.40 和2853.17 cm-1兩處吸收也有所增強(qiáng)，此外，凝血酶磁珠在1546.36 cm-1處的酰胺鍵特征吸收也證實(shí)凝血酶成功固定在磁珠上。

A.SiO2修飾磁性納米顆粒；B.環(huán)氧硅烷化磁性納米顆粒；C.凝血酶磁珠；D.萃取后的凝血酶磁珠。

運(yùn)用透射電鏡對(duì)EMNP、凝血酶磁珠和磁固相萃取后的凝血酶磁珠的形態(tài)和尺寸進(jìn)行表征，結(jié)果見(jiàn)圖3。形態(tài)上，3種磁珠幾乎呈球形，EMNPs呈現(xiàn)清晰的核-殼結(jié)構(gòu)，直徑約為50 nm，萃取前后凝血酶磁珠直徑相仿，均約為EMNPs的5倍，文獻(xiàn)記載修飾后的磁納米粒直徑會(huì)增大[21]，與實(shí)驗(yàn)過(guò)程以及FT-IR結(jié)果相符。

A.環(huán)氧硅烷化磁性納米顆粒；B.凝血酶磁珠；C.萃取后的凝血酶磁珠。

良好的酶活性穩(wěn)定性是固定化酶的特征和優(yōu)勢(shì)[20，22-24]。穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)中，按照“1.5”項(xiàng)下的酶活性檢測(cè)步驟，分別測(cè)定凝血酶磁珠、游離凝血酶在37 ℃、19 d間的酶活性，上述實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。固定化酶和游離凝血酶酶活性穩(wěn)定性見(jiàn)圖4，10次活性檢測(cè)結(jié)果中，固定化酶的酶活力值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)為4.74%，而游離酶的RSD為22.96%，表明固定化酶的酶活性穩(wěn)定性更好。

圖4 固定化和游離凝血酶在37 ℃、19 d內(nèi)儲(chǔ)存穩(wěn)定性

2.2轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析Illumina測(cè)序后，鑒定出24 625 284個(gè)原始序列讀長(zhǎng)(raw reads)，過(guò)濾含有低質(zhì)量堿基數(shù)(即Q ≤ 5)超過(guò)該條序列讀長(zhǎng)(read)堿基數(shù)50%，N堿基含量超過(guò)該read堿基數(shù)10%以及含有測(cè)序接頭序列或含有poly-A的測(cè)序reads，最終獲得24 321 945條高質(zhì)量序列讀長(zhǎng)(clean reads)，使用Trinity(版本2.6.6)軟件進(jìn)行序列組裝，將組裝的轉(zhuǎn)錄組序列中最長(zhǎng)的序列作為后續(xù)分析的基因序列，共產(chǎn)生308 343個(gè)基因序列，長(zhǎng)度分布在201～21 552 bp，N50長(zhǎng)度為501 bp。選取合適的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列構(gòu)建水蛭唾液腺的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，將現(xiàn)有的序列采用blastp算法比對(duì)到NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的非冗余蛋白質(zhì)序列庫(kù)(Nr數(shù)據(jù)庫(kù))和UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋匹配，最終得到13條水蛭素變體序列。

2.3水蛭抗凝成分篩選

2.3.1SDS-PAGE以及凝血酶滴定法驗(yàn)證電泳結(jié)果見(jiàn)圖5，泳道1為蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，L3樣品的主要蛋白條帶的相對(duì)分子質(zhì)量為45 000，為非特異性結(jié)合到磁珠上的蛋白。與L3樣品比較，L2樣品含有更寬泛的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量條帶，而L1樣品蛋白條帶多數(shù)小于15 000。多肽如水蛭素是水蛭中最強(qiáng)效抗凝血成分[4-5，25]，因此推測(cè)L2和L1中小分子多肽為抗凝多肽。

1.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.陰性對(duì)照樣品(L3)；3.萃取后樣品(L2)；4.萃取前樣品(L1)。

2.3.2LC-MS/MS鑒定結(jié)果樣品經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)比對(duì)后，共鑒定到蛋白1325種，其中L2樣品中1094種，L1樣品中987種，重疊蛋白數(shù)756。L1的注釋率為76%，L2樣本的注釋率為60%。

據(jù)文獻(xiàn)[25-26]記載，水蛭素是從吸血水蛭中分離出來(lái)的具有最強(qiáng)抗凝活性的天然凝血酶抑制劑，它可以直接與凝血酶的催化活性位點(diǎn)以及外結(jié)合域1結(jié)合。蛋白1023，1062，1230，1275和1323均為水蛭素變體(表1)，在Nr或Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)分別為APA20860.1，ALA14574.1，Q07558.1，P81492.2和APA20860.1，這5種肽在L2樣品中均能檢測(cè)到，而在L1樣品中均由于豐度極低而未能檢測(cè)，這是由于凝血酶磁珠對(duì)凝血酶抑制劑具有特異性富集效應(yīng)。

表1 匹配日本醫(yī)蛭唾液腺轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)所得蛋白比對(duì)結(jié)果

另外也鑒定出了非凝血酶抑制劑的抗血栓生物分子如失穩(wěn)酶蛋白質(zhì)834和846，它可以通過(guò)解聚穩(wěn)定的纖維蛋白，但不與凝血酶活性位點(diǎn)結(jié)合而表達(dá)血栓溶解活性[25，27]，在L2以及L1樣本中均能檢測(cè)到相應(yīng)的肽段數(shù)，這是由于磁珠的親水性Fe3O4核心以及硅烷涂層、聚山梨酯-20的疏水烷基會(huì)增強(qiáng)非特異性蛋白的吸附[28-29]。

3 討論

在本研究中，凝血酶通過(guò)三步修飾反應(yīng)成功固定到磁珠，并且酶活性穩(wěn)定性以及宏觀磁性良好，該方法原理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，適用于蛋白質(zhì)類(lèi)以及其他含有氨基的化合物的固定化實(shí)驗(yàn)。維持最佳凝血酶活力的pH值約為7.4，而條件優(yōu)化的最佳緩沖液pH值為8，這是由于凝血酶固定化反應(yīng)過(guò)程中加入了一種強(qiáng)酸(H2SO4)弱堿(NH3·H2O)鹽硫酸銨，它會(huì)一定程度上下調(diào)緩沖液pH值[30]。比例優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，高比例EMNPs可以提供更多的環(huán)氧基團(tuán)以確保與凝血酶的共價(jià)連接，但磁珠的聚集也更顯著，而聚集現(xiàn)象會(huì)大大減少固定化酶活性位點(diǎn)的暴露[22]，因此，本研究以單位酶活性值為優(yōu)化指標(biāo)，確定最佳比例。在磁固相萃取實(shí)驗(yàn)中，本研究以30%乙腈溶液1 mL振蕩2 min，洗脫1次作為洗脫條件，測(cè)得洗脫液抗凝活性為70 U·g-1，當(dāng)對(duì)磁珠再次洗脫后，所得洗脫溶液不具有抗凝活性，30%乙腈溶液1 mL洗脫一次能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求。

水蛭原液抗凝活性為1380 U·g-1，10 mg磁珠所得洗脫液的抗凝活性為70 U·g-1，回收率約為5.1%。本實(shí)驗(yàn)中為了保持磁珠“垂釣”抗凝成分的作用并且降低經(jīng)濟(jì)成本，限制了凝血酶的固定量，因而凝血酶的固定量較少，主要起到“垂釣”抗凝成分的作用，如果需要提高富集效果，可以增加固定凝血酶的比例?？紤]到日本醫(yī)蛭缺乏參考基因組信息，針對(duì)大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜檢索靈敏度低并且假陽(yáng)性率高的問(wèn)題[31]，因而構(gòu)建了日本醫(yī)蛭唾液腺轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)并翻譯為氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)用于蛋白質(zhì)譜鑒定，該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，適用于特定樣本的蛋白質(zhì)譜研究[32-33]，其中采用磁珠法進(jìn)行mRNA的富集純化，該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、純化效果好的特點(diǎn)[34-35]。

總之，通過(guò)結(jié)合磁固相萃取，轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)建立以及LC-MS/MS技術(shù)，本研究建立了一種不需要復(fù)雜前處理即可從天然復(fù)雜樣本中快速篩選和鑒定目標(biāo)生物活性大分子的方法，可為水蛭中抗凝生物活性分子的萃取以及鑒定提供參考。