茶樹G4基因克隆及其在白茶萎凋過程中的表達模式分析

ZARIPOV TIMUR，周承哲，2，謝思藝，田采云，石碧瀅，朱 晨，2，郭玉瓊*

（1.福建農林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福建福州350002；2.福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州350002）

茶樹[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]作為一種重要的木本經濟作物，具有極大的經濟、藥用和文化價值[1-4]。葉綠素具有吸收和傳遞光能的能力，在植物生長發(fā)育中起著重要作用，其含量是決定葉片顏色的關鍵因素[5-6]。高等植物中的葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b，其中葉綠素a合成的最后一步是7-丙酸與C20聚異戊二烯醇葉黃醇的酯化反應，這一過程依賴于葉綠素a合成酶的作用[7]，目前已在擬南芥等植物中鑒定出其編碼基因（G4）[8]，然而在茶樹中尚未見有關G4基因的克隆研究。盡管葉綠素不溶于水，對茶湯的色澤影響較小[9]，但葉綠素的含量對干茶色澤品質仍然具有重要影響[10]。已有相關研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量與白茶干茶色澤品質呈正相關[11-12]。白茶作為福建的特種茶之一，因其具有較強的保健功效而深受廣大消費者的喜愛[13-14]。萎凋作為白茶加工過程中最關鍵的工藝，對白茶獨特品質形成具有決定性影響[15-16]。白茶萎凋過程中茶葉受到脫水脅迫，從而影響葉綠素的降解，最終形成白茶灰綠的色澤[15]。為更好地了解白茶萎凋過程中葉綠素含量變化規(guī)律及葉綠素a合成基因G4對葉綠素含量的合成調控作用，該研究對茶樹G4基因進行克隆并進行相關生物信息學分析。同時，對白茶萎凋過程中G4的相對表達量和葉綠素含量進行分析，以期為揭示G4在白茶萎凋過程中作用機理及其對葉綠素含量影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料來源。供試植物材料取自福建農林大學教學實踐茶園（26°05′N，119°14′E）的‘福鼎大白’茶樹品種。按照白牡丹白茶采摘標準，從8株長勢一致，無病蟲害的‘福鼎大白’茶樹均一地采取一芽二葉茶樹嫩梢用于后續(xù)分析。

1.1.2 主要試劑。DreamTaq Green Mix酶，T1載體，T1感受態(tài)細胞，GelGreen熒光核酸凝膠染色劑，DEPC-H2O，75%乙醇。

1.2 方法

1.2.1 白茶萎凋處理。將茶葉置于室內進行48 h自然萎凋，攤葉厚度為1 cm，設置萎凋溫度（25±2）℃，相對空氣濕度60%±3%。每12 h（0、12、24、36、48 h）進行取樣，每次取樣進行3次生物學重復，共獲得15份樣品，并對所有樣本的表型進行記錄。將上述樣品分別置于錫箔紙袋中，液氮固樣后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葉綠素含量測定。葉綠素含量按北京索萊寶科技有限公司試劑盒說明書進行測定，稱取葉片中段，稱取0.1 g切成小塊，用蒸餾水洗滌。樣品在研缽中研磨，加入試劑后，轉移到試管中，用80%（V/V）丙酮稀釋至10 mL。在弱光條件下進行制備，試管在室溫下置于黑暗處3 h，直到底部的組織殘留物完全變白。用分光光度計測定葉綠素a（645 nm）和葉綠素b（663 nm）的吸光度。葉綠素a和b和總含量按下列公式計算：

其中，V代表上清液體積；F代表稀釋倍數(shù)；m代表樣品重量。

1.2.3 茶樹總RNA提取及cDNA合成。參照TransZol-Up RNA提取試劑盒說明書（全式金，北京，中國）提供的方法從所有茶葉樣品中提取總RNA。使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，并利用NanoDrop 2000紫外分光光度計（Thermo Scientific，威爾明頓，美國）檢測其OD值，選取OD260/OD280值在1.8~2.0的RNA樣本按照HifairRⅡ1st Strand cDNASynthesis Ki（t翊圣，上海，中國）說明書提供方案進行逆轉錄合成第一鏈cDNA用于CsG4克隆和qRTPCR分析。

表1 引物序列

1.2.4 CsG4的cDNA全長克隆。檢索GenBank中已公布植物的G4序列，設計ORF全長驗證相關引物（表1）。以‘福鼎大毫’茶樹葉片cDNA為模板，進行PCR擴增。參照Lin等的方法，將擴增后的目的基因片段進行膠回收，T1為載體轉入T1感受態(tài)中，挑選出陽性克隆子委托鉑尚生物技術（福州）有限公司進行測序。

1.2.5 茶樹CsG4序列分析。利用ExPASyProtParam對CsG4進行蛋白質基本理化性質分析；EMBnetTmpred、WoLFPSORT、SignaIP5.0Server、SOPMA以及STRING等在線工具分別用于蛋白跨膜區(qū)域預測、亞細胞定位、信號肽、蛋白質二級結構和蛋白互作關系分析；利用NetPhos3.1Server預測磷酸化位點、PONDR預測蛋白序列的無序區(qū)、Coils用于卷曲螺旋預測；并SWISS-MODEL用于模擬蛋白質三級結構；采用MEGA 7軟件中的鄰近相連法并設置bootstrap1000次重復以構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.6 qRT-PCR定量表達分析。利用DNAMAN軟件設計CsG4異性引物進行qRT-PCR檢測（表1）。進行qRT-PCR擴增，擴增結束后進行溶解曲線分析驗證引物特異性，試驗進行3次重復，采用2-△△Ct算法計算定量結果。

2 結果與分析

2.1 CsG4的cDNA克隆與序列分析

以‘福鼎大白’茶樹葉片cDNA為模板，進行PCR擴增，經電泳檢測、膠回收純化和測序后，獲得CsG4的cDNA序列，該序列全長1 125 bp，共編碼374個氨基酸（圖1）。將CsG4在NCBI中進行blast比對，結果顯示CsG4與杜鵑、大麻、咖啡、楊樹和葡萄等多種植物的G4所編碼的氨基酸序列具有84.1%以上的相似性，同源性較高。將CsG4氨基酸序列與茶樹基因組氨基酸序列進行多序列比對，結果顯示CsG4氨基酸序列與茶樹基因組中轉錄本的氨基酸序列（TEA017076.1）相似度為82.9%（圖2）。為進一步驗證所克隆CsG4序列的正確性，利用‘福云六號’茶樹葉片進行克隆，將克隆所得G4序列與CsG4序列進行多序列比對后發(fā)現(xiàn)，二者相似性為92.66%，表明所克隆的G4序列的正確性，但不同茶樹品種之間可能存在序列差異。

圖1 CsG4基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

2.2 CsG4編碼蛋白特征

利用ExPASy ProtParam網站分析該基因編碼蛋白的基本理化性質，結果表明CsG4相對分子量為40.49 kD，原子組成為C1872H2932N470O515S7，原子總數(shù)5 796；由20種氨基酸組成，其中Leu（14.4%）、Ala（10.2%）、Gly（8.6%）、Ser（7.0%）和Ile（6.7%）等5個氨基酸含量較為豐富，而His（0.8%）和Met（0.8%）這2種氨基酸含量最少，含有帶負電氨基酸（Asp+Glu）共26個，帶正電氨基酸（Arg+Lys）共30個；理論等電點（pI）為8.74；不穩(wěn)定系數(shù)為25.76；總平均疏水性為0.313，推測該蛋白為穩(wěn)定、疏水的酸性蛋白。

蛋白質的功能與結構密切相關，利用SOPMA在線分析工具預測CsG4蛋白的二級結構，結果顯示其主要為49.47%α-螺旋、11.76%延伸鏈、4.55%β-轉角和34.22%不規(guī)則卷曲結構（圖3）。利用EMBnet-Tmpred預測蛋白跨膜區(qū)，結果顯示CsG4蛋白存在7個跨膜區(qū)域（圖4A），在93-113、169-187、223-240和317-339位氨基酸存在由內向外的蛋白跨膜區(qū)域，最高分值為1 747分；在120-138、195-213、224-270及355-374位氨基酸存在由外向內的跨膜區(qū)域，最高分值為1 753分，推測CsG4蛋白屬于跨膜蛋白。利用WoLFPSORT和SignaIP5.0分別對CsG4蛋白進行亞細胞定位和信號肽分析（圖4B），結果表明CsG4編碼蛋白主要定位于葉綠體，不具有信號肽。利用NetPhos3.1對CsG4蛋白所含的磷酸化位點進行預測，結果顯示（圖5）該序列含有34個磷酸化位點，分別為15個Thr位點、14個Ser位點和4個Tyr位點，能被蛋白激酶C（PKC）和酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）等蛋白激酶磷酸化。利用PONDR在線預測軟件對G4蛋白序列進行無序區(qū)預測，結果顯示，無序區(qū)段主要位于1-2、13-37、43-60、80-98、155-164和373-374 6個區(qū)段，占比20.32%。利用Coils工具預測對CsG4蛋白卷曲螺旋形態(tài)進行預測，結果顯示CsG4蛋白存在卷曲螺旋。利用SWISS-MODEL對CsG4蛋白進行三維結構預測，預測結果表明（圖6A）CsG4蛋白主要結構元件為α-螺旋。通過STRING對CsG4蛋白潛在的互作關系進行預測分析（圖6B），參照擬南芥蛋白質數(shù)據(jù)庫，G4與AT1G74470和PCB2的互作系數(shù)分別為0.997和0.997，與ALB1的互作系數(shù)為0.995。

圖2 CsG4氨基酸序列多重比對

圖3 CsG4蛋白的二級結構預測分析

圖4 CsG4蛋白跨膜區(qū)域預測及信號肽分析

2.3 CsG4氨基酸序列進化樹分析

為進一步了解CsG4在不同物種間的進化關系，將CsG4蛋白與其他植物的G4蛋白進行氨基酸多序列比對，并利用MEGA7軟件構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，茶樹CsG4與杜鵑（Rhododendron dauricum）和咖啡（Coffea arabica）等植物的親緣關系最近，與毛果楊（Populus trichocarpa）和楊樹（Populus euphratica）的親緣關系較遠（圖7）。

2.4 白茶萎凋過程中葉片表型變化

為了解白茶萎凋過程中葉片色澤的變化，對萎凋葉每隔12 h拍攝一次照片，發(fā)現(xiàn)茶葉中的水分含量不斷減少。在48 h時，顏色從最初的黃綠色變?yōu)榘稻G色，其中芽和第1片葉子的變化更為明顯（圖8）。

2.5 白茶萎凋過程中葉綠素含量變化分析

為了解白茶萎凋過程中葉綠素含量變化，對萎凋過程中‘福鼎大毫’茶樹葉片中的葉綠素含量進行測定。結果表明，白茶萎凋48 h時，葉綠素含量比茶樹鮮葉下降了近2倍。葉綠素a的降解率高于葉綠素b，chl a/chl b的相關性不斷降低（圖9）。

2.6 茶樹CsG4在白茶萎凋中的表達分析

為了解CsG4在茶葉在萎凋過程中的表達水平，利用qRT-PCR技術對其表達量進行定量分析。結果顯示，白茶萎凋過程中，CsG4的相對表達量顯著降低，且與萎凋過程中葉綠素含量總體變化趨勢呈正相關（圖10）。這些結果表明，葉綠素含量和相關基因表達的降低可能是由采摘損傷和萎凋引起的脫水脅迫，推測可能是植物對脅迫產生了應激反應。

3 討論

白茶萎凋過程中葉片綠色消失是由葉綠素降解引起的，因此對葉綠素合成相關基因進行分子克隆，了解其編碼蛋白的理化性質及其在白茶萎凋過程中的表達具有重要意義。該研究表明，CsG4的cDNA序列，全長1 125 bp，共編碼374個氨基酸，存在7個跨膜區(qū)域，且CsG4編碼蛋白主要定位于葉綠體，不具有信號肽。以‘福鼎大毫’茶樹葉片為材料對G4進行克隆，克隆所得序列與茶樹基因組中CsG4氨基酸序列與茶樹基因組中轉錄本序列（TEA017076.1）相似度為82.9%，為驗證所克隆CsG4序列的正確性，利用‘福云六號’茶樹葉片進行克隆，將克隆所得G4序列與CsG4序列進行多序列比對后發(fā)現(xiàn)，二者相似性為92.66%，進一步驗證所克隆的G4序列的正確性。而這種差異可能是茶樹品種差異導致的。

圖5 CsG4蛋白所含的磷酸化位點

圖7 CsG4系統(tǒng)進化樹分析

圖6 CsG4蛋白三維結構預測及蛋白互作分析

葉綠素代謝可能是影響白茶萎凋過程中葉色變化的關鍵因素。對白茶萎凋過程中茶葉中葉綠素含量進行測定后發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量隨萎凋時間延長總體呈下降趨勢，這一變化規(guī)律與白茶凋萎過程中CsG4的表達量變化趨勢一致。推測白茶萎凋過程中CsG4表達對葉綠素含量變化具有重要調控作用。

茶葉顏色是白茶品質的指標之一，因此更好地了解白茶萎凋過程中葉綠素代謝的機制值得深入研究。該研究以期為揭示CsG4在白茶萎凋過程中作用機理及其對葉綠素含量影響提供理論依據(jù)。

圖8 白茶萎凋過程中葉片表型變化

圖9 白茶凋萎過程中葉綠素含量變化

圖10 白茶萎凋過程中茶樹CsG4表達分析