尿液結(jié)合珠蛋白水平及其基因型對早期糖尿病腎病的診斷價值

宋欣 張永 張慶紅 孟忠吉 胡雪梅

2型糖尿病(T2DM)患者中約34.7%發(fā)生糖尿病腎病(DKD)[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，40%～50%的終末期腎病(ESRD)是由DKD引起，DKD是糖尿病患者重要的死亡原因之一。目前DKD的診斷主要依靠臨床診斷和病理診斷，腎活檢的開展受到地區(qū)、經(jīng)濟(jì)、患者差異等情況的限制。尿白蛋白排泄率(UAER)或尿白蛋白/肌酐(UACR)是目前被廣泛應(yīng)用的DKD早期診斷指標(biāo)，但白蛋白尿作為DKD診斷標(biāo)志物的效能受到許多因素的限制[2]。相關(guān)研究表明，40%的1型糖尿病(T1DM)患者和30%的T2DM患者可出現(xiàn)尿蛋白的自發(fā)性消退，20%尿蛋白正常的T2DM患者表現(xiàn)出早期腎小球?yàn)V過率(GFR)進(jìn)行性下降[3]，特別是在藥物干預(yù)的情況下，這種情況更為常見[4]。近年來，通過對DKD新型診斷標(biāo)志物的探索發(fā)現(xiàn)，結(jié)合珠蛋白(Hp)水平及其基因型與DKD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5-6]。本研究旨在探討尿液Hp(uHp)對DKD的診斷價值及Hp基因多態(tài)性與DKD易感性之間的關(guān)系。

對象與方法

1.對象：2018年9月～2019年9月于十堰市太和醫(yī)院就診的T2DM患者(UAER<30 mg/24 h)29例(單純T2DM組)，年齡15～75歲。T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國糖尿病腎病防治指南(2019年版)》中T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入同期于我院就診的DKD患者61例，按照UAER水平將其分為早期DKD組(30 mg/24 h≤UAER<300 mg/24 h，33例)和臨床DKD組(UAER≥300 mg/24 h，28例)。排除標(biāo)準(zhǔn)：T1DM、急慢性感染、嚴(yán)重心腦血管疾病、其他系統(tǒng)性或活動性疾病(如血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、結(jié)締組織病或惡性腫瘤等)、妊娠、精神異常、DKD以外的腎臟疾病患者。隨機(jī)選取同期于我院體檢的30例健康者為健康對照組。本研究通過十堰市太和醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(2020KS016)，所有患者均知情同意。

2.方法

(1)一般資料收集：收集所有受試者的一般資料，包括性別、年齡、體重、吸煙史、收縮壓及病例組患者的病程。

(2)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測：所有受試者于清晨空腹取靜脈血5 ml，分離血漿和血細(xì)胞，于-80 ℃冰箱凍存；取晨尿10 ml，于-80 ℃冰箱凍存。采用全自動生化分析儀檢測所有受試者血尿素(Urea)、血肌酐(SCr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、尿β2微球蛋白(β2-MG)、24小時尿蛋白排泄率(UAER)，計(jì)算GFR。采用武漢云克隆公司的人結(jié)合珠蛋白試劑盒(SEA817Hu)檢測uHp水平。

(3)Hp基因型測定：采用天根公司人血液基因組DNA提取試劑盒(DP318-02)提取血液基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測Hp基因型。參考Koch等[7]的試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)引物，用上游引物A(5’-GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG-3’)，下游引物B(5’-GAGATTTTTGAGCCCTGGCTGGT-3’)擴(kuò)增1 757 bp的Hp1片段和3 481 bp的Hp2片段，用上游引C(5’-CCTGCCTCGTATTAACTGCACCAT-3’)和下游引物D(5’-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3’)擴(kuò)增349 bp的Hp2片段。PCR反應(yīng)體系為模板DNA 2 μl，dNTP，上下游引物各0.5 μl，加入ddH2O補(bǔ)足20 μl。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性1 min，62 ℃退火和延伸3 min，共35個循環(huán)；72 ℃終末延伸7 min。產(chǎn)物采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)125 V電泳20 min，在紫外光下觀察。

結(jié) 果

1.4組受試者一般資料和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較：4組受試者性別、年齡、吸煙史、Urea比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。單純糖尿病組、早期DKD組及臨床DKD組患者的收縮壓、HbA1c、尿液β2-MG、UAER、uHp水平均高于健康對照組，GFR水平低于健康對照組(P<0.05)。健康對照組、單純T2DM組、早期DKD組及臨床DKD組患者uHp水平依次升高，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.各組HP基因型比較：共檢測出Hp1-1、Hp1-2、Hp2-2 3種基因型(圖1)。圖1中條帶1為DNA Marker 2 000 bp的電泳條帶，條帶2、3、4和條帶5、6、7代表的樣本呈一一對應(yīng)關(guān)系。條帶2、3、4為引物A和引物B擴(kuò)增產(chǎn)物，其中1 757 bp的片段為含Hp1等位基因；條帶5、6、7為引物A和引物B擴(kuò)增產(chǎn)物，其中349bp的片段為含Hp2等位基因。條帶2、5對應(yīng)患者的基因型為Hp1-1，條帶3、6和條帶4、7分別對應(yīng)患者的基因型為Hp1-2、Hp2-2。另外，還擴(kuò)增出含750bp的片段，經(jīng)查證為引物B單獨(dú)擴(kuò)增序列[8]。3種Hp基因型在各組頻率見表2。3種基因型在4組受試者中的頻率分布為Hp1-1基因型最少，Hp2-2基因型頻率最高。Hp2-2基因型頻率在對照組最低，在臨床DKD組最高，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.525)。Hp1-1及Hp1-2基因型頻率在在4組受試者中的分布無明顯規(guī)律，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.525)。

注：條帶2、5為Hp1-1基因型，3、6為Hp1-2基因型，4、7為Hp2-2基因型，1為DNA Marker 2000bp圖1 Hp基因型電泳結(jié)果

表2 3種Hp基因型在4組患者中出現(xiàn)的頻率[例，(%)]

3.uHp、UAER、尿液β2-MG水平對早期DKD的診斷價值：以GFR為標(biāo)準(zhǔn)繪制uHp、UAER、尿液β2-MG對DKD診斷的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn),uHp的ROC曲線下面積(AUC)明顯大于UAER及尿液β2-MG的AUC(P<0.001)。見圖2、表3。

表3 uHp、UAER、尿液β2-MG對DKD的診斷價值

圖2 uHp、UAER、尿液β2-MG對DKD透析的ROC曲線

討 論

DKD屬于T2DM嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病患者不良預(yù)后的重要因素。由最初的腎小球高濾過到出現(xiàn)大量蛋白尿的過程中，腎功能的進(jìn)展逐漸加速。在DKD早期階段，腎小球結(jié)構(gòu)的完整性大多得到保留，晚期時腎小球結(jié)構(gòu)被破壞、濾過屏障受損、腎小管損傷、間質(zhì)纖維化，病情難以逆轉(zhuǎn)，因此早期預(yù)測并進(jìn)行干預(yù)尤其重要[9-10]。

本研究首先比較了健康人群及不同階段DKD患者的uHp水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著病情進(jìn)展，uHp濃度逐漸升高，表明uHp與DKD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。為了解uHp對DKD的預(yù)測價值進(jìn)一步繪制了ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)uHp的AUC明顯大于UAER和尿液β2-MG，表明uHp對DKD的診斷效能優(yōu)于UAER及尿液β2-MG。約登指數(shù)取最大值時,得到uHp的最佳診斷界值為36.68 ng/ml，即當(dāng)uHp>36.68 ng/ml時診斷DKD具有較高的診斷價值，此時診斷的敏感度和特異度分別為86.7%、64.9%。

Hp主要合成場所在肝臟，但在皮膚、脂肪組織、肺及腎臟也有表達(dá)[11]，在人體內(nèi)發(fā)揮清除血紅蛋白、促進(jìn)血管生成、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用。T2DM患者的紅細(xì)胞脆性增加，游離Hb增多[12-13]；DKD早期，腎小球呈高濾過狀態(tài)，血液中Hp經(jīng)腎小球?yàn)V過增多；另一方面，在DKD早期，Hp在腎臟的表達(dá)反應(yīng)性增多；此外，DKD患者腎間質(zhì)受累，腎小管上皮細(xì)胞損傷凋亡增加，Hp從脫落的近端小管上皮細(xì)胞進(jìn)入管腔，最終出現(xiàn)DKD患者尿液中Hp濃度升高。

研究表明，Hp基因型決定了Hp在患者體內(nèi)表達(dá)的差異，另外，不同基因型的Hp產(chǎn)物在功能上可能存在差異，主要表現(xiàn)在結(jié)合游離Hb的差異及其與巨噬細(xì)胞表面CD163親和力的差異[14]。因此，不同Hp基因型與疾病的易感性也有所不同，Hp基因型可能同樣對DKD有潛在預(yù)測價值[14]。我們進(jìn)一步分析了Hp基因型頻率在各組的差異，但并未發(fā)現(xiàn)Hp與DKD進(jìn)展間存在顯著關(guān)聯(lián)?；谝陨辖Y(jié)果，我們分析可能原因如下：一方面，本研究樣本量較小，可能不能很好代替總體；另一方面，雖然本試驗(yàn)盡量避免了試驗(yàn)操作因素造成的誤差，但仍不排除試驗(yàn)過程中人為因素的干擾；第三，由于Hp基因型頻率受年齡、種族、地域等影響[15]，我們的研究僅基于十堰及周邊地區(qū)的T2DM患者，結(jié)果是否普遍適用還需進(jìn)一步大規(guī)模探索。

綜上，本文就uHp水平在DKD早期診斷中的價值進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)uHp水平隨DKD病情進(jìn)展逐步升高，其對DKD的診斷效能優(yōu)于UAER和尿液β2-MG，對DKD早期診斷有很大價值，作為一種無創(chuàng)、簡便的檢查手段，在臨床上可以彌補(bǔ)單獨(dú)使用尿白蛋白進(jìn)行診斷的不足。另外，盡管Hp基因型影響Hp在人體的表達(dá)，但我們的實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)DKD的進(jìn)展與Hp基因型之間顯著相關(guān)，其中的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。