基于SSNNPP分子標記的玉米雜交種基因型分析與純度鑒定

尹祥佳，李 晶，王雅琳，王劍虹，翟 琛，郝 楠，焦珍珍

（1.蘭州職業(yè)技術學院 甘肅，蘭州 730070；2.北京通州國際種業(yè)科技有限公司 北京 101100）

玉米(Zea mays L.)是我國第一大糧食作物，也是重要的飼料和工業(yè)加工原料[1-2]。中國報告網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，我國2019年玉米播種面積達到4128萬hm2，總產(chǎn)量達到2.6億噸，玉米種植面積和總產(chǎn)量均為糧食作物之首，對保障我國糧食安全起到了關鍵作用。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2019 年底我國玉米品種審定總數(shù)為14495 個，其中國審品種1978個，地方審定品種數(shù)12517個。

近些年，我國玉米制種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了豐富的玉米種植品種數(shù)量。甘肅省是國內(nèi)重要的玉米制種地基，在河西走廊建有國家級的玉米種子生產(chǎn)基地。據(jù)相關文獻報道[3]，2019 年全省有玉米種子企業(yè)130 家，玉米種子生產(chǎn)面積8.26萬hm2，產(chǎn)種5億公斤，面積和產(chǎn)量分別占全國玉米制種總面積和總產(chǎn)量的48%和51%。玉米種子質(zhì)量是保障玉米種植業(yè)發(fā)展的重要生產(chǎn)資料，直接影響到玉米種植的產(chǎn)量和糧食品質(zhì)。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，SNP分子標記技術已經(jīng)應用于玉米種質(zhì)資源的遺傳背景和多樣性分析、遺傳圖譜構建、品種真實性和純度鑒定、分子輔助選擇育種等方面。何冰紓等[4]應用SNP分子標記對陜單609的雜種優(yōu)勢模式進行了分析，對于玉米自交系的選育和組配提供了依據(jù)。鄭德波等[5]利用SNP 對2 個F2:3 群體對株高和穗位高性狀進行了分析，發(fā)掘出了一些新的株高和穗位高的QTL。吳金鳳等[6]采用SNP 標記分析了51 份玉米自交系的基因型，并將其劃分成了7 個雜種優(yōu)勢群，有效提高了玉米新品系的選育效率。覃嘉明等[7]應用SNP 構建玉米高密度遺傳圖譜，研究得出了控制玉米禿尖的主效QTL。李雪等[8]采用SNP 芯片檢測技術研究了先玉335、鄭單958和京玉7號等11份玉米雜交種的品種真實性，同時與SSR 熒光標記分析進行了比較研究。姚宗澤等[9]驗證了SNP 檢驗玉米雜交種純度的可靠性，擴展了玉米雜交種純度的鑒定方法。因此我們選取6 份甘肅省內(nèi)推廣的玉米雜交種作為研究對象，應用LGC SNP 高通量基因分型檢測平臺（KASP 技術）開展玉米雜交種基因型分析與純度鑒定研究，為我省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略背景下玉米制種品種質(zhì)量監(jiān)測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在玉米種子市場購買了金穗1203、金穗4 號、武科8號、金艾130、方玉36和甘玉801等6份玉米雜交種作為試驗材料。

1.2 SNP標記引物

利用Primer Express Software v3.0.1 軟件設計擴增引物和分型探針，并由生物技術公司合成，SNP標記信息見表1。

表1 SNP標記信息

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA提取 根據(jù)文獻[10]的報道，采取改良的CTAB 法提取基因組DNA。DNA 質(zhì)量和濃度用Nano-Drop2000(Thermo Scientific)紫外分光光度計進行測定，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量，調(diào)節(jié)工作液濃度。

1.3.2 PCR 反應體系 PCR 反應體系配置在96 孔板中，反應體系為5μl，其中，DNA(50ng/μl)1μl，KASP Mix2.5μl，primer Mix0.1μl，ddH2O1.4μl。PCR 反應程序為95℃預變性5min，95℃變性30s，57℃復性60s，72℃延伸30s，35個循環(huán)后72℃終延伸10min，4℃Forever，復性溫度根據(jù)不同引物進行調(diào)整。

1.3.3 玉米雜交種的SNP 基因型分析和純度鑒定 每份雜交玉米種隨機取96 粒種子作為檢測樣品，采取改良的CTAB法提取基因組DNA后用SNP標記引物分別進行PCR 反應，然后用LGC SNP 高通量基因分型檢測平臺讀取數(shù)據(jù)。計算玉米雜交種的純度公式為P（%）=(NT-ND)/NT×100，其中，P為種子純度；NT供檢種子數(shù)；ND雜交種子數(shù)。

2 結果與分析

2.1 玉米樣品基因組DNA提取質(zhì)量分析

用NanoDrop2000紫外分光光度計測定提取的玉米雜交種基因組DNA 濃度，并調(diào)節(jié)濃度為50ng/μl，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，檢測結果見圖1，結果表明，提取的玉米基因組DNA質(zhì)量適合PCR擴增。

2.2 SNP基因型分析與純度鑒定結果

每份玉米品種隨機選取96粒種子樣品單獨提取基因組DNA 作為PCR 擴增模板，分別用SNP 標記引物進行了基因型分析（圖2）和純度鑒定（表2）。等位基因的探針分別是VIC（綠色）和FAM（藍色）。純度鑒定值在95.83%-98.96%之間，符合玉米雜交種純度的國家標準。

圖1 玉米基因組DNA檢測結果

圖2 玉米品種的SNP基因型分析結果

表2 純度鑒定結果

3 結論與討論

隨著基因組測序技術的發(fā)展，研究者開發(fā)了大量的玉米SNP標記位點，隨著各種檢測平臺的推廣使用，玉米品種的SNP 鑒定技術也在快速發(fā)展[11]。SNP 標記技術已經(jīng)被國際植物新品種保護聯(lián)盟（UPOV）推薦為農(nóng)作物品種鑒定和指紋數(shù)據(jù)庫的方法之一，主要有SNP芯片平臺、樣本高通量的原位掃描平臺（LGC公司KASP技術，Life公司Taqman技術）、位點和樣本高通量的靶向測序技術等，數(shù)據(jù)讀取基于二等位變異和熒光檢測系統(tǒng)[12-15]。

目前，SNP 分子標記技術作為第三代分子標記技術，應用于玉米雜交種純度的鑒定成為重要的研究內(nèi)容。SNP分子標記在玉米種子質(zhì)量檢測過程中具有一定的技術優(yōu)勢：一是具備高通量檢測的技術支撐，二是標記位點在玉米10 條染色體上分布密度高且分布均勻，檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計比較簡單，軟件直接讀出試驗結果；三是檢測過程不需要聚丙烯酰胺凝膠電泳，所用試劑相比較SSR 標記的危害較小，符合綠色環(huán)保的要求。

SNP 分子標記相比較其它分子標記，在玉米基因型分析和品種純度鑒定中的應用將更加廣泛。我們采用SNP 分子標記中的KASP 技術對甘肅省內(nèi)推廣的6 份玉米雜交種進行了純度鑒定，結果顯示4對SNP引物均能準確的得出試驗數(shù)據(jù)，純度鑒定結果在95.83%-98.96%之間，說明了SNP 分子標記KASP 技術結果可靠，能夠有效實現(xiàn)了高效率、高靈活性、簡便快捷、低成本的檢測技術優(yōu)勢，可以作為玉米雜交種純度檢測的新方法，并在今后基于SNP標記的玉米品種分子鑒定中發(fā)揮越來越重要的作用，能夠有效為我省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略背景下玉米制種品種質(zhì)量監(jiān)測技術研究提供技術參考。