阜新地區(qū)肉及肉制品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

蔡楠楠 夏紅 杜波 任妍妍 修敏 劉文新 張眉眉

（1.阜新市疾病預(yù)防控制中心 遼寧阜新 123000；2.遼寧省疾病預(yù)防控制中心）

1 前言

產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌， 是一種條件致病菌，是人獸共患病原菌，嚴(yán)重威脅動(dòng)物及人類公共衛(wèi)生安全[1-2]。 產(chǎn)氣莢膜梭菌鏡下，觀察革蘭氏染色呈紫色，形態(tài)為粗短芽孢桿菌，在微需氧或者厭氧條件下生長(zhǎng)良好。 在自然環(huán)境中以及人和動(dòng)物胃腸道中廣泛存在。該菌較容易導(dǎo)致人類食物中毒、傷口處的創(chuàng)傷性壞疽以及禽類和牲畜類的壞死性腸炎。 該菌所產(chǎn)生的毒素至少有15 種以上，目前根據(jù)主要的致死性毒素 α、β、ε 和 t 將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為 A，B，C，D，E 這 5 種類型[3]。 其中 A 型是主要對(duì)人致病的類型，C 型占少數(shù)。 致病因素主要與腸毒素（CPE 和β2毒素）有關(guān)。 其中A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒在美國(guó)等西方國(guó)家居前三[3]。 在我國(guó)，對(duì)生禽肉、牲畜肉及相應(yīng)肉類制品的需求量很大， 但對(duì)這些肉及肉制品的加工處理過程不當(dāng)， 均有可能造成產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。

對(duì)2018～2020 年食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，阜新地區(qū)的肉及肉制品中所獲得的產(chǎn)氣莢膜梭陽(yáng)性菌株進(jìn)行典型生化特性試驗(yàn)、毛細(xì)管電泳分型、進(jìn)化樹分析和耐藥性分析， 了解當(dāng)?shù)厝饧叭庵破犯腥镜漠a(chǎn)氣莢膜梭的主要分型和耐藥情況， 為由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的人類食物中毒及動(dòng)物的壞死性腸炎的診斷和防治提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

樣品采集于2018～2020 年阜新市五區(qū)兩縣（細(xì)河區(qū)、海州區(qū)、太平區(qū)、清河門區(qū)、新邱區(qū)、阜蒙縣和彰武縣）各大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)肉及肉制品攤位，按分層隨機(jī)采樣原則采集74 份鮮肉及鮮肉制品， 其中鮮雞肉16 份，鮮牛肉 12 份，鮮豬肉 12 份，鮮羊肉 12 份，預(yù)包裝雞肉制品10 份，調(diào)理肉制品12 份，每份樣品至少采集500 g，4 h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源

參考菌株：產(chǎn)氣莢膜梭菌A 型（ATCC13124）由省疾病預(yù)防控制中心食品所保存， 產(chǎn)氣莢膜梭菌B型（NCTC13110）、產(chǎn)氣莢膜梭 C 型（NCTC8081）等由阜新市衛(wèi)生健康服務(wù)中心保存。對(duì)照菌株：金黃色葡萄球菌ATCC29213、 大腸埃希氏菌ATCC25922，蠟樣芽孢桿菌CMCC （B）63301 等由阜新市衛(wèi)生健康服務(wù)中心保存。 生化鑒定、毛細(xì)管電泳分型鑒定，作為質(zhì)控，均同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.3 儀器與試劑

智能氣體工作站MARKⅡ，毛細(xì)管電泳儀（QIAGEN公司），測(cè)序結(jié)果來(lái)源于QIAGEN 公司，耐藥試劑來(lái)自杭州微生物試劑有限公司。NA 顆粒、TSC、含鐵牛乳等培養(yǎng)基均來(lái)源于青島海博生物技術(shù)有限公司；Ex Ta8 DNA 聚合酶為寶生物有限公司產(chǎn)品；PCR引物、探針委托Invitrogen 公司合成。

2.4 細(xì)菌分離與鑒定

細(xì)菌的分離取樣品25 g 放入225 ml 0.1%蛋白胨水中進(jìn)行稀釋，吸取稀釋液1 ml 加入平皿，將稀釋液加入9 ml 生理鹽水， 以此類推做2～3 個(gè)稀釋度。加TSC 培養(yǎng)基后搖勻，36℃厭氧培養(yǎng)20 h。按照《2018～2020 年國(guó)家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)程序，挑取相應(yīng)黑色菌落接種于血平皿，36℃厭氧培養(yǎng)20 h，選取出具有雙層溶血環(huán)的菌落接種FTG 培養(yǎng)基，36℃厭氧培養(yǎng)20 h。

生化鑒定參照 《2018～2020 年國(guó)家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》 產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)程序及標(biāo)準(zhǔn)生化試劑盒說(shuō)明書， 主要有牛奶發(fā)酵試驗(yàn)、硝酸鹽動(dòng)力試驗(yàn)及乳糖明膠試驗(yàn)。

2.5 基因分型

2.5.1 基因組DNA 提取

用接種環(huán)刮取1/4 血平皿上培養(yǎng)物加入碩世提取試劑盒，制成混懸液。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取。

2.5.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參考文獻(xiàn)[4]合成 6 對(duì)引物（見表1）：cpa、cpb、etx、iA、cpe、cpb2，分別擴(kuò)增產(chǎn)氣莢膜梭菌 α、β、ε、ι、β2 和 CPE 毒素。

表1 擴(kuò)增產(chǎn)氣莢膜梭菌的六種毒素基因的引物序列

2.5.3 PCR 分型

按照表1 引物序列擴(kuò)增相應(yīng)毒素基因。 多重PCR 反應(yīng)總體系為 25 μl，ta8 酶 Mix2 μl，上下游引物各 1 μl（10 μmol/L），無(wú) RNA 酶水 19 μl，模板 DNA2 μl[5]。 PCR 反應(yīng)程序：94℃ 10 min，94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 1 min 30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保存[5]。用毛細(xì)管凝膠電泳分析觀察PCR 產(chǎn)物的結(jié)果。

α 毒素基因與 16SrRNA 基因分析。 將 PCR 產(chǎn)物送Invitrogen 有限公司進(jìn)行測(cè)序。 用DNAStar 軟件對(duì)分離株和參考株序列進(jìn)行α 毒素基因同源性分析；用MegAlign 軟件構(gòu)建16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析[6，9]。

2.6 藥敏試驗(yàn)

研究依據(jù)紙片擴(kuò)散法[7-8]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。 藥敏紙片分別為紅霉素、多西四環(huán)素、青霉素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢氨芐、頭孢曲松、頭孢呋辛、米諾環(huán)素、氨芐西林、丁胺卡那、哌拉西林[9]。 將22 株菌株接種于鮮血瓊脂平皿，36℃恒溫厭氧培養(yǎng)18 h。刮取鮮血瓊脂平皿上適量菌落， 用生理鹽水稀釋至0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，吸取0.2 mL 菌懸液，放置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿，L 棒將菌液均勻放置于整個(gè)平皿。用經(jīng)過高壓滅菌的鑷子將藥敏紙片貼于平皿中的培養(yǎng)基表面，每個(gè)平皿貼四張，調(diào)整紙片間距離，使間距至少為24 mm。 紙片中心與平皿邊緣的距離應(yīng)至少為15 mm，菌落涂布后15 min 內(nèi)將貼完紙片。 翻轉(zhuǎn)平皿，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h。游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑＜10 mm 為耐藥 （R），10～15 mm 為中度敏感（I），＞15 mm 為高度敏感（S），＞20 mm 極敏感。

3 結(jié)果

3.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定

3.1.1 病原的分離

分離的菌株在TSC 上呈黑色，帶暈環(huán)或不帶暈環(huán)， 在鮮血瓊脂平皿上成圓形或菌落邊緣呈鋸齒狀或放射狀、光滑、灰白色、中等或偏大，厭氧培養(yǎng)18 h內(nèi)層呈清晰狹小的透明溶血環(huán)、外層不完全溶血。

3.1.2 生化試驗(yàn)

在共計(jì)74 份肉及肉制品樣品中分離出22 株產(chǎn)氣莢膜梭菌。 其中 2018 年 6 株，2019 年 9 株，2020年7 株。 按照各種微量生化發(fā)酵管說(shuō)明書對(duì)分離株和A 型標(biāo)準(zhǔn)菌株的純培養(yǎng)進(jìn)行生化試驗(yàn)。 牛奶發(fā)酵試驗(yàn)有很明顯的發(fā)酵現(xiàn)象，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵乳糖，液化明膠，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，動(dòng)力陰性，上述特點(diǎn)符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)特性。

3.2 基因分型

通過常規(guī)細(xì)菌分離和系列生化鑒定試驗(yàn)， 分離出的22 株產(chǎn)氣莢膜梭菌， 均擴(kuò)增出A 型產(chǎn)氣莢膜梭特異的324 bp 條帶，與預(yù)期擴(kuò)增出的cpa 基因片段大小一致。 未擴(kuò)增出 cpb、etx 和 iA、cpe 基因的特異性條帶，表明22 株產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A 型，未發(fā)現(xiàn)其他菌型（B、C、D、E）。進(jìn)一步擴(kuò)增 β2毒素基因和CPE 基因， 發(fā)現(xiàn) 3 種基因型分別為：β2毒素陰性、CPE 陰性的 A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌；β2毒素陽(yáng)性、CPE陰性的A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌；β2毒素陽(yáng)性、CPE 陽(yáng)性的A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌； 未檢測(cè)出β2毒素陰性、CPE陽(yáng)性的A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

表2 不同肉及肉制品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定

3.3 α 毒素同源性分析

對(duì)22 株分離株α 毒素基因序列分析顯示， 分離株 C.perfringen 201901、C.perfringen 201902、C.perfringen 201905、C.perfringen 202004、C.perfringen 202006 之間以及 C.perfringen 201801、C.perfringen 201804 之間α 毒素基因序列同源性較高，同源性為100%， 而分離株 C.perfringen 201805、C.perfringen 201907 之間α 毒素基因序列同源性最低，同源性為93.6%。

3.4 16S rRNA 基因分析

16S rRNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，22 株分離株中存在一個(gè)大簇， 本簇中， 除C.perfringen 202007和 C.perfringen 201903 這 2 株外， 均為 2018 年的分離株，而且分離株C.perfringen 201805 與標(biāo)準(zhǔn)菌株C.perfringen ATCC 13124 親緣關(guān)系最近， 基因離散率為0.786%。2019 年的2 株分離株C.perfringen 201906 和C.perfringen 201907 在進(jìn)化樹中呈單獨(dú)一個(gè)分支，平均基因離散率為4.373%。

表3 22 株產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分型結(jié)果

圖1 22 株產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

3.5 藥敏試驗(yàn)

共22 株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明， 所有菌株對(duì)多西四環(huán)素敏感，敏感率為100%；對(duì)卡那霉素、慶大霉素耐藥，耐藥率為100%；對(duì)頭孢氨芐、米諾環(huán)素、多西四環(huán)素的敏感率均達(dá)到了90%以上。 在對(duì)22株菌落耐藥實(shí)驗(yàn)的過程中，發(fā)現(xiàn)202001 和202004對(duì)頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐西林和哌拉西林出現(xiàn)抑菌環(huán)上又重新覆蓋菌落的情況。耐藥情況詳見表4。

表4 22 株肉及肉制品中產(chǎn)氣莢膜梭的耐藥性檢測(cè)結(jié)果

4 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens）是人獸共患病原菌，能對(duì)人和多種動(dòng)物致病。產(chǎn)氣莢膜梭菌除患病動(dòng)物體內(nèi)感染外，在宰殺、儲(chǔ)藏、配送等環(huán)節(jié)中對(duì)肉及肉制品的不當(dāng)操作中，也很容易造成外在感染[10-11]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)需要特殊的厭氧條件和設(shè)備，加上特殊的采樣方式、專用的培養(yǎng)基和鑒定試劑等，一般的實(shí)驗(yàn)室難以開展對(duì)該菌的研究，因此對(duì)該菌及其在食物中毒產(chǎn)生的不良影響缺少認(rèn)識(shí)[12]。 雖然國(guó)外有厭氧菌引起食物中毒的相關(guān)報(bào)道， 但系統(tǒng)的研究肉及肉制品產(chǎn)氣莢膜梭的感染情況及與食物中毒關(guān)系在國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道，在本地區(qū)更是空白[13]。在社會(huì)對(duì)食品安全問題日漸重視的今天， 對(duì)食品中厭氧菌的危險(xiǎn)性應(yīng)該進(jìn)行評(píng)估。 本次研究對(duì)肉及肉制品中產(chǎn)氣莢膜梭菌感染情況進(jìn)行分析， 初步了解了食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染情況、 菌型分布和耐藥情況。

阜新地區(qū)各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)出售的肉及肉制品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌污染，本研究從74 份肉及肉制品中分離出的22 株產(chǎn)氣莢膜梭菌。分離到的產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌，沒有發(fā)現(xiàn)該菌的其它菌型（B、C、D、E），這與相關(guān)報(bào)道一致[14]。 其中以鮮禽肉（鮮雞肉） 中帶菌率最高。 僅攜帶β2毒素基因的為11 株， 并檢出一株同時(shí)攜帶β2基因和CPE 基因的產(chǎn)氣莢膜梭菌。本研究利用生化鑒定，結(jié)合毛細(xì)管電泳對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株進(jìn)行基因分型具有快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)， 采用紙片法對(duì)22 株細(xì)菌進(jìn)行耐藥實(shí)驗(yàn)。這為開展產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)流行病學(xué)研究以及對(duì)不同型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的不同疾病的快速大規(guī)模診斷提供了實(shí)用手段[15，16]。

本研究在一定程度上對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素分型，進(jìn)化樹分析，分子生物學(xué)上進(jìn)行了研究，同時(shí)也為進(jìn)一步核糖體基因分型（Ribotyping）、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）等分子分型和調(diào)查本地區(qū)厭氧菌在食物中毒產(chǎn)生的影響以及與食源性疾病的關(guān)系奠定了研究基礎(chǔ)。

本研究顯示， 分離株 C.perfringen 201901、C.perfringen 201902、C.perfringen 201905、C.perfringen 202004、C.perfringen 202006 之間以及 C.perfringen 201801、C.perfringen 201804 之間 α 毒素基因序列同源性為100%， 而分離株C.perfringen 201805、C.perfringen 201907 之間α 毒素基因序列同源性為93.6%。 22 株分離株中存在1 個(gè)大簇，除C.perfringen 202007 和 C.perfringen 201903 這 2 株外，均為2018 年的分離株，而且分離株C.perfringen 201805與標(biāo)準(zhǔn)菌株C.perfringen ATCC 13124 親緣關(guān)系最近。

研究表明在對(duì)2018～2020 年肉及肉制品中分離出的22 株產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)卡那霉素、慶大霉素完全耐藥，原因可能與該地區(qū)禽類、牲畜肉飼養(yǎng)過程中長(zhǎng)期使用這些藥有關(guān)。2020 年分離出的菌株202001和202004 對(duì)頭孢曲松、頭孢呋辛、氨芐西林和哌拉西林這幾種藥出現(xiàn)了抑菌環(huán)中重新生長(zhǎng)出大片菌落的現(xiàn)象，隨著這幾類藥物的長(zhǎng)期使用，產(chǎn)生了耐藥突變株。 分離出的菌株對(duì)多西四環(huán)素的敏感率達(dá)到100%，對(duì)頭孢氨芐和米諾環(huán)素的敏感率也達(dá)到90%以上。如果發(fā)生感染，早期使用這3 種藥物會(huì)有很好的效果， 提倡在臨床用藥前進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以達(dá)到有的放矢的效果。

本次研究結(jié)果表明， 在阜新地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)出售的肉與肉制品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌和可以導(dǎo)致人食物中毒的腸毒素陽(yáng)性A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌污染。 這是食品安全中的一個(gè)隱患。 該菌作為一種重要的致人腹瀉和傷口感染的病原菌，污染情況應(yīng)引起重視。為有效預(yù)防該菌致病事件出現(xiàn)， 市場(chǎng)部門和衛(wèi)生部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管， 對(duì)可能引起污染的環(huán)節(jié)制定相應(yīng)的預(yù)防措施。應(yīng)加強(qiáng)食品安全的宣傳，指導(dǎo)群眾在處理肉及肉制品過程中要注意生熟分開，勤洗手，避免帶傷操作。