化妝品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)能力的驗(yàn)證方法與結(jié)果研究

時(shí)慧 寧曉文 閆愛(ài)莉

（丹東市疾病預(yù)防控制中心 遼寧丹東 118000）

1 前言

化妝品是人們生活中經(jīng)常使用的物品， 常與人體皮膚緊密接觸，如果化妝品中出現(xiàn)微生物，則會(huì)使化妝品受到污染，進(jìn)而給人們的皮膚造成影響。近年來(lái)我國(guó)對(duì)化妝品質(zhì)量的要求不斷提升， 在檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)部分化妝品中含有較多的金黃色葡萄球菌，這一類微生物會(huì)給消費(fèi)者的健康造成威脅。 因此必須要對(duì)化妝品中的金黃色葡萄球菌實(shí)施有效檢測(cè)，以保證化妝品的安全性。

2 材料與方法

2.1 材料選擇

2.1.1 培養(yǎng)基

SCDLP 液體培養(yǎng)基、Baird Parker 瓊脂基礎(chǔ)、金黃色葡萄球菌顯色平板、BHI 肉湯； 血瓊脂平板；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.1.2 試劑

凍干兔血漿；卵黃亞蹄酸鉀增菌液；對(duì)金黃色葡萄球菌實(shí)施檢測(cè)的單重?zé)晒釶CR 檢測(cè)試劑盒。

2.1.3 儀器

立式的壓力蒸汽滅菌鍋；生物安全柜；可以擁有電熱和恒溫保持功能的培養(yǎng)基培養(yǎng)箱；離心機(jī)；可以進(jìn)行PCR 檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀； 型號(hào)為DM500 的顯微鏡；德國(guó)所生產(chǎn)的漩渦混合器[1]。

2.1.4 樣本選擇

選擇接受NIFDC-PT-188 化妝品能力驗(yàn)證的化妝品樣本，樣品的顏色為白色，樣品的狀態(tài)為球狀，將樣品放置在西林瓶的內(nèi)部， 要求在瓶底中含有一定量的粉底膏，并且要求真空狀態(tài)。

2.1.5 菌種

金黃色葡萄球菌；表皮葡萄球菌。

2.2 方法

2.2.1 對(duì)樣品實(shí)施前處理

將樣品放置在生物安全柜中， 并在柜子的內(nèi)部將樣品打開(kāi)，保證處于無(wú)菌操作的狀態(tài)，并向裝有2個(gè)樣品的瓶中加入SCDLP 液體式的培養(yǎng)基，加入量為6 ml。 將樣本進(jìn)行搖晃， 使其可以呈現(xiàn)均勻的狀態(tài)，并以分散式的形式存在。此次樣品中含有較多的水分，具體的狀態(tài)為塊狀，并且較為粘稠，不容易溶解。將樣品置于滅菌試管的內(nèi)部，使用液體式的培養(yǎng)基對(duì)西林瓶實(shí)施潤(rùn)洗操作， 同時(shí)取出金黃色葡萄球菌液體，放在培養(yǎng)基中作為陽(yáng)性的對(duì)照組，另一組單獨(dú)取培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組[2]。

2.2.2 使用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)

將所形成的對(duì)照組別以及樣本液體放置在36℃的環(huán)境下，保持1 d，達(dá)到增菌培養(yǎng)的效果。之后進(jìn)行分離培養(yǎng)，主要包括初步分離以及分純培養(yǎng)，前者需要將其放置在平板以及顯色平板的上方， 置于36℃環(huán)境下平板培養(yǎng)2 d，顯色平板培養(yǎng)1 d。最后進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，主要包括3 種檢驗(yàn)方式，分別為染色鏡檢鑒定、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)鑒定、血漿凝固酶試驗(yàn)。

2.2.3 使用實(shí)時(shí)熒光 PCR 法進(jìn)行檢測(cè)

選擇100 μl 量的增菌培養(yǎng)液，將其放置到無(wú)菌離心管的內(nèi)部，將離心的速度設(shè)置為8 000 r/min，持續(xù)離心3 min，盡可能將清液吸取上來(lái)，同時(shí)加入50 μl 的DNA 抽提液，將兩者混合之后將其放置于100℃的環(huán)境下保持10 min 的恒溫狀態(tài)， 之后進(jìn)行離心，離心速度為13 000 r/min，持續(xù)離心3 min。離心之后對(duì)清液進(jìn)行提取。之后準(zhǔn)備空白、陰性和陽(yáng)性的對(duì)照以及2 個(gè)樣本，每一種的量都為5 μl，將蓋子蓋好，并將其放入到檢測(cè)儀器的內(nèi)部。

3 結(jié)果分析

3.1 國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果

在顯色平板上所體現(xiàn)的結(jié)果雖然可以對(duì)兩種菌落進(jìn)行分析，但是由于其生長(zhǎng)狀態(tài)為交叉性，難以準(zhǔn)確選擇出具有可疑性的菌落， 為了提升挑選的菌落具有代表性， 之后在顯色平板的上方進(jìn)行了再次分離， 將具有代表性的菌落放在血瓊脂平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)， 最終使得菌落的顏色和形態(tài)處于基本一致的狀態(tài)[3]。

國(guó)標(biāo)法檢測(cè)后2 個(gè)樣品均呈現(xiàn)出渾濁的狀態(tài)，分離培養(yǎng)結(jié)果相同。 在Baird Parker 平板之中顯示為2 種不同分菌落形態(tài)，菌落均呈現(xiàn)為呈圓形，且表面均較為光滑，擁有凸起的位置，顏色均屬于黑色，但是其中一個(gè)菌落的周圍出現(xiàn)了渾濁帶， 在外層出現(xiàn)了透明圈。在顯色平板上方出現(xiàn)2 種菌落形態(tài)：菌落均呈現(xiàn)為呈圓形，且表面均較為光滑，擁有凸起的位置，但是顏色一個(gè)為藍(lán)色，一個(gè)為粉紫色。 在血瓊脂平板上菌落為金黃色，屬于圓形，表面光滑但是不透明，在菌落的周圍有溶血圈出現(xiàn)。陽(yáng)性對(duì)照組也屬于渾濁的狀態(tài)，在Baird Parker 平板之中菌落為呈圓形，且表面均較為光滑，擁有凸起的位置，顏色均屬于黑色，菌落的周圍出現(xiàn)了渾濁帶，在外層出現(xiàn)了透明圈。在顯色平板上方菌落呈現(xiàn)為呈圓形，且表面均較為光滑，擁有凸起的位置，粉紫色。 在血瓊脂平板上分離培養(yǎng)結(jié)果與2 個(gè)樣品相同。 陰性對(duì)照組屬于澄清的狀態(tài)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)結(jié)果

3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)結(jié)果

Ct 值見(jiàn)表2，檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1。 經(jīng)過(guò)檢測(cè)之后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)空白和陰性的對(duì)照組產(chǎn)生了FAM熒光信號(hào)，但是在陽(yáng)性對(duì)照的檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了這一信號(hào)，并且檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)為擴(kuò)增的狀態(tài)，曲線形態(tài)為“S”型，Ct 值在 16.97 之下，代表此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有有效性。 在2 份檢測(cè)樣品中均檢測(cè)出了信號(hào)，并且其信號(hào)樣式與陽(yáng)性對(duì)照組相同，2 組樣品的Ct值分別為17.5 以及 21.19，2 個(gè)樣品Ct 值都在35 之下，這代表在此次研究過(guò)程中在2 個(gè)樣品內(nèi)均檢測(cè)出了金黃色葡萄球菌，和國(guó)標(biāo)法檢測(cè)樣品的結(jié)果屬于一致?tīng)顟B(tài)。

表2 檢測(cè)樣品Ct 值

圖1 擴(kuò)增曲線

4 討論

在本次研究中出現(xiàn)了假陽(yáng)性的問(wèn)題， 大概率是由于在檢驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有按照相關(guān)的規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，環(huán)境也有可能存在一定的問(wèn)題，導(dǎo)致交叉污染問(wèn)題的出現(xiàn)。 假陰性結(jié)果出現(xiàn)的主要原因?yàn)榕囵B(yǎng)基沒(méi)有達(dá)到原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和要求， 在分離鑒定過(guò)程中所使用的方法較為單一，以及檢驗(yàn)人員沒(méi)有充分、熟練地掌握操作技術(shù)等問(wèn)題。 此次2 種檢測(cè)方法均具有不同的優(yōu)勢(shì)以及劣勢(shì)，例如PCR 法所需要使用的檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)準(zhǔn)確度高，但是容易受到外界各種因素的影響，對(duì)于檢測(cè)人員的技能要求較高。