液相色譜法在茶葉殘留農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用

李思龍 劉睿 孫崳林 李啟艷

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心 山東 濟(jì)南 250101）

1 前言

近年來茶葉的質(zhì)量安全問題已成為制約茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要原因， 其中， 農(nóng)藥殘留問題受到重點(diǎn)關(guān)注， 已成為了食品安全領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容。 為了解決此類問題， 有關(guān)部門提出了茶葉殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法， 要求產(chǎn)出及投入市場(chǎng)的茶葉必須經(jīng)過第三方單位的專業(yè)認(rèn)證才能進(jìn)行檢測(cè)， 檢測(cè)數(shù)據(jù)合格后才能食用[1]。 基于此，我國引入了液相色譜法，此種方法是指將液體作為流動(dòng)相的色譜法。在研究中，將具有色素的提取液滴入裝有硫酸鈣粒子的玻璃器皿上，并持續(xù)用石油醚清洗玻璃器皿，使液體中含有的不同色素得到分解，進(jìn)而形成不同顏色的色譜帶。其中每個(gè)顏色代表的色素種類不同， 進(jìn)而便可掌握滴入的液體中具體含有哪種色有哪種色有哪種色素。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新與實(shí)踐探究， 此種方法的應(yīng)用范圍越來越廣。 在應(yīng)用中這種方法不僅可以將液體中的有機(jī)物質(zhì)分解，同時(shí)在研究中發(fā)現(xiàn)，色譜法對(duì)于分解透明的無色物質(zhì)也起到一定作用。 區(qū)別于液相色譜法， 傳統(tǒng)方法無法直接通過色譜圖對(duì)物質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行直接判斷，因此在對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，需要將結(jié)果與定性標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比對(duì)， 但這些問題均在高效液相色譜法中被解決。 將此種方法應(yīng)用到茶葉殘留農(nóng)藥檢測(cè)中， 可根據(jù)其中農(nóng)藥的種類與數(shù)量對(duì)農(nóng)藥殘留的時(shí)間性與空間性進(jìn)行分析[2]。 在此過程中值得注意的是，茶葉中殘留農(nóng)藥的來源不同，因此在色譜上呈現(xiàn)的種類也是多樣化的， 這種殘留主要通過農(nóng)藥的滲透與土壤的聚類。 基于此， 本文引入液相色譜法，開展茶葉殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)，了解茶葉中農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀，進(jìn)而保障茶葉質(zhì)量安全。

2 茶葉殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法設(shè)計(jì)

2.1 提取凈化茶葉殘留農(nóng)藥樣本

對(duì)茶葉殘留農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)的前提條件是對(duì)樣本的選擇，本章將引入液相色譜法，進(jìn)行凈化樣本的提取。

（1）將茶葉浸泡在蒸餾水中，并將浸泡液體分裝在儲(chǔ)液瓶?jī)?nèi)。 使用分布器進(jìn)行2.0 μm 的過濾。 同時(shí)進(jìn)行樣本到出口的檢查，使用高壓泵與液壓泵對(duì)經(jīng)過過濾的浸泡液進(jìn)行提取。按照導(dǎo)出液體顏色的比對(duì)進(jìn)行溶液脈沖消除工作，并采用抽真空的方式，持續(xù)抽氣[3]。 直至浸泡液流經(jīng)過濾器，對(duì)溶液進(jìn)行反壓力調(diào)節(jié)，截止此步驟，完成茶葉農(nóng)藥檢測(cè)樣本的初步調(diào)制。

（2）采用微波輔助色譜萃取的方式，將初步制備的樣本進(jìn)行提純處理： 將初期制備的農(nóng)藥與茶葉混合溶液放在離心立管中，在滴管中摻入清水浸泡3～7 min；加入乙腈，使用高速旋轉(zhuǎn)的勻漿設(shè)備，持續(xù)工作至少1.0 min；根據(jù)溶液量加入適量的Nacl，持續(xù)攪拌1.0 min 后靜置放置30 min；取上層清液，將其放置在梨形器皿中，保持過程溫度在37.0℃～38.5℃之間，將其采用旋轉(zhuǎn)的方式對(duì)其風(fēng)干；再次加入乙腈在梨形器皿中，將其搖勻。

（3）在加樣前使用5.0 ml 的預(yù)淋液，當(dāng)液面達(dá)到吸附層表面時(shí)， 在容器邊緣壁里快速倒進(jìn)液體凈化試劑[4]。 并使用刻度瓶對(duì)洗脫液進(jìn)行收集， 等待HPLC 檢測(cè)。

2.2 基于液相色譜法計(jì)算茶葉殘留農(nóng)藥色譜波長(zhǎng)

在完成對(duì)檢驗(yàn)樣本的凈化后， 要對(duì)獲取到的溶液進(jìn)行提純處理，以此明確色譜的檢測(cè)條件。本章選擇使用液相色譜法，對(duì)樣本進(jìn)行提純。殘留雜質(zhì)的農(nóng)藥樣本可表示為下述公式。

公式（1）中：R 表示為含有雜質(zhì)殘留的茶葉殘留農(nóng)藥溶液；a 表示為被檢測(cè)得含有的農(nóng)藥；b 表示為檢測(cè)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)色譜；s 表示為檢測(cè)端。 根據(jù)上述計(jì)算公式，在實(shí)際檢測(cè)中，需要根據(jù)檢測(cè)端，獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行溶液配置分析。 將精確到一定量的樣本中摻入甲醇試劑， 并按照計(jì)算中含有農(nóng)藥的指數(shù)進(jìn)行定容稀釋[5]。 過濾其中的不溶物質(zhì)，或?qū)⑵潇o止后取其清液。

以此獲取溶液中被稀釋為濃度后的農(nóng)藥樣本溶液，在多個(gè)樣本溶液中隨機(jī)選取1 支預(yù)處理流動(dòng)相，在進(jìn)樣器中滴注多次純水。 此時(shí)使用色譜試紙對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)后，可得知溶液中農(nóng)藥陰離子的活化時(shí)間。對(duì)色譜試紙顯示陰離子存活時(shí)間的計(jì)算可如下述公式表示。

公式（2）中：T 表示為色譜試紙顯示樣本試劑中陰離子的存活時(shí)間；r-表示為樣本溶液中的陽離子表示方法；r-表示為樣本溶液中的陰離子；h 表示為有機(jī)濾膜；t 表示梯度洗脫時(shí)間。 在完成上述計(jì)算的同時(shí)， 使用溶劑較大的平頭滴管深入到預(yù)處理的流動(dòng)相液體中，并將其采用高溫的方式烘干，將進(jìn)樣設(shè)備在色譜條件下提取的不同稀釋溶液分別添加到預(yù)處理溶液中，完成對(duì)茶葉殘留農(nóng)藥的提取[6]。 再制定茶葉殘留農(nóng)藥的不同檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)， 選擇將不同標(biāo)準(zhǔn)的離子色譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到樣品當(dāng)中， 再使用樣品，采用同樣的方式，對(duì)其流動(dòng)相進(jìn)行處理。 并記錄檢測(cè)過程中各金屬離子的譜圖， 通過相應(yīng)的數(shù)據(jù)計(jì)算出溶液中不同殘留的農(nóng)藥回收率。計(jì)算公式如下。

公式（3）、（4）中：W 表示為茶葉殘留農(nóng)藥含量；ρ 表示為不同離子物質(zhì)的濃度；A 表示為茶葉樣本農(nóng)藥溶液體積；I 表示為進(jìn)樣體積；P 表示為茶葉殘留的農(nóng)藥回收率；X 表示為檢測(cè)樣本總體積。根據(jù)上述計(jì)算公式中對(duì)回收率進(jìn)行計(jì)算， 分離茶葉殘留農(nóng)藥樣本中小分子離子， 基于不同農(nóng)藥離子具備的排斥性能， 將其按照離子色譜檢測(cè)劃分為負(fù)價(jià)陰離子與正價(jià)陽離子[7]。 陰離子中應(yīng)包括氟離子、氯離子、磷硫離子、氮氧離子等，在此基礎(chǔ)上，計(jì)算多余影響離子色譜檢測(cè)的等價(jià)元素， 按照元素梯度計(jì)算茶葉殘留農(nóng)藥色譜波長(zhǎng)。 計(jì)算公式如下。

公式（5）中：λ 表示為茶葉殘留農(nóng)藥色譜波長(zhǎng)；Δy 表示為干涉元素色譜波長(zhǎng)間距；b 表示為雙峰間距；D 表示為雙峰垂直距離。 根據(jù)上述計(jì)算公式，分析樣本溶液中農(nóng)藥殘留的陰離子濃度， 為了避免在適宜的環(huán)境下陰離子與陽離子發(fā)生交換反應(yīng)， 使用淋洗裝置對(duì)樣本進(jìn)行加熱處理[8]。 并選擇離子色譜代替?zhèn)鹘y(tǒng)檢測(cè)中使用的其它化學(xué)物質(zhì)， 分離有機(jī)酸與無機(jī)酸，簡(jiǎn)化傳統(tǒng)的檢測(cè)過程，在此過程中并不使用其它檢測(cè)裝置，以此可有效的控制檢測(cè)成本，避免技術(shù)應(yīng)用過程中無用功的消耗。

2.3 繪制殘留農(nóng)藥指紋檢測(cè)圖譜

為了進(jìn)一步提升檢測(cè)結(jié)果的精度，在完成上述相關(guān)工作后， 可采用繪制殘留農(nóng)藥指紋檢測(cè)圖譜的方式，進(jìn)行預(yù)測(cè)組與評(píng)估組的綜合分析。

（1）采用可量化的鑒定與繪制手法，將其建立在多種化學(xué)成分分析的基礎(chǔ)上[9]。 在建立過程中注意數(shù)據(jù)的真實(shí)性與時(shí)效性， 并在此基礎(chǔ)上分析農(nóng)藥所含的化學(xué)物質(zhì)與種類， 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)茶葉殘留農(nóng)藥的進(jìn)一步描述與評(píng)價(jià)。

（2） 在上述基礎(chǔ)上， 對(duì)其進(jìn)行與液相色譜的比對(duì)， 使茶葉質(zhì)量與其農(nóng)藥含量在真正意義上結(jié)合起來， 此種方法不僅對(duì)闡明茶葉中農(nóng)藥含量有著顯著的作用，還可為相關(guān)茶葉類型的農(nóng)藥檢測(cè)提供參考。

（3）獲取樣本溶液，并把提取的混合溶液裝入離子色譜檢測(cè)設(shè)備中，按照設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程，設(shè)置相對(duì)適宜的檢測(cè)環(huán)境。 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果中顯示的不同離子的峰值及相應(yīng)的濃度檢測(cè)結(jié)果， 使用最小二乘法計(jì)算出測(cè)得的數(shù)據(jù)， 并將數(shù)據(jù)結(jié)果擬合成色譜圖形， 得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)當(dāng)大于或等于99.99%。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相應(yīng)參數(shù)，按照一定的出峰時(shí)間對(duì)離子進(jìn)行定性， 再利用外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行定量，獲取到最準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，以此完成對(duì)殘留農(nóng)藥指紋檢測(cè)圖譜的繪制[10]。綜上所述，通過提取凈化茶葉殘留農(nóng)藥樣本、 計(jì)算茶葉殘留農(nóng)藥色譜波長(zhǎng)完成對(duì)茶葉中殘留農(nóng)藥的檢測(cè)。

3 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

3.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

本文針對(duì)茶葉殘留農(nóng)藥，提出一個(gè)簡(jiǎn)單的測(cè)試。根據(jù)市場(chǎng)內(nèi)茶葉生產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)及針對(duì)其生產(chǎn)茶葉使用農(nóng)藥現(xiàn)狀，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過程的具體規(guī)劃。在市場(chǎng)上選擇一個(gè)茶葉生產(chǎn)商作為研究對(duì)象， 并隨機(jī)選擇其產(chǎn)出的茶葉作為研究樣本。

布設(shè)此次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境， 檢測(cè)所需的儀器設(shè)備應(yīng)包括：高壓/低壓輸液裝置、液體分析柱、波長(zhǎng)檢測(cè)裝置等。 檢測(cè)樣本為含量為99.5%的BSRM 試劑樣本、內(nèi)標(biāo)色譜級(jí)試紙。 樣本相關(guān)配置：精準(zhǔn)的稱量標(biāo)有一定量的茶葉樣本，將其平均分為兩組，使用蒸餾水對(duì)兩組茶葉樣本進(jìn)行充分浸泡， 使其中的農(nóng)藥成分在蒸餾水中充分溶解， 其中每組樣本溶液中的含有的農(nóng)藥種類均為4 種， 檢測(cè)結(jié)果圖每測(cè)得出現(xiàn)一個(gè)峰值便代表測(cè)出一種農(nóng)藥種類。 使用實(shí)驗(yàn)滴管收集部分樣本溶液，按照一定比例將其定容稀釋。對(duì)于其中的不溶解物質(zhì)， 可采用靜置獲取清液或使用專門的過濾器對(duì)溶液進(jìn)行過濾的方式， 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)樣本的獲取。 在此基礎(chǔ)上，選擇合適的波長(zhǎng)試紙，按照“0.1”、“0.2”、“0.3”、“0.4” 濃度的樣本溶液分別進(jìn)行標(biāo)樣。為了確保實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的可分析性，按照波長(zhǎng)應(yīng)遵循完整性與靈敏性兩項(xiàng)原則。 控制實(shí)驗(yàn)中的其它選擇條件： 將實(shí)驗(yàn)全過程的溫度控制在適宜溫度范圍內(nèi)（32℃±0.05），若超出常規(guī)溫度控制范圍會(huì)出現(xiàn)基線偏移，以此造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)誤差，與此同時(shí)還會(huì)對(duì)保留行為造成一定的影響，在此基礎(chǔ)上，控制樣本檢測(cè)的進(jìn)樣量， 采用少量多次檢測(cè)取平均值的方式，提高檢測(cè)結(jié)果的精度。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在完成上述相關(guān)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作后， 分別采用本文設(shè)計(jì)的基于液相色譜法的茶葉殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法， 分別對(duì)樣本溶液進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)。 設(shè)定本文方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為A 組，傳統(tǒng)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為B 組， 根據(jù)稀釋后不同濃度的溶液，繪制兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)定曲線圖。 如下圖1 所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比圖

如上述圖1 所示， 為本次茶葉殘留農(nóng)藥檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，從上述圖中可以清楚的看出，A 組為本文檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 其中曲線圖中共出現(xiàn)4 個(gè)峰值，代表檢測(cè)出樣本溶液中含有的農(nóng)藥種類為4 種。B 組為傳統(tǒng)檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 其中曲線圖中共出現(xiàn)2 個(gè)峰值， 代表檢測(cè)出樣本溶液中含有的農(nóng)藥種類為2 種。 并且根據(jù)兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)峰間距的分析，可得出此次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論：相比傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法， 本文提出的基于液相色譜法的茶葉殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法在實(shí)際檢測(cè)過程中， 可測(cè)得的農(nóng)藥種類更多、分辨率更高，更適用于對(duì)茶葉生產(chǎn)過程中農(nóng)藥的控制與環(huán)境的監(jiān)測(cè)。

4 討論

茶葉中由于殘留農(nóng)藥而出現(xiàn)與國際貿(mào)易出口商品不匹配的問題屢見不鮮，因此在生產(chǎn)茶葉過程中，除了需要對(duì)相關(guān)施藥設(shè)備與技術(shù)進(jìn)行不斷改良外，也需要設(shè)計(jì)一個(gè)優(yōu)化的茶葉農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，進(jìn)而使更多優(yōu)質(zhì)的茶葉流入市場(chǎng)， 為此本文從3 個(gè)方面，基于液相色譜法，開展了茶葉殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)。 并通過了大量的應(yīng)用實(shí)踐與對(duì)比實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了設(shè)計(jì)的方法在實(shí)施中具有一定的可行性， 并能根據(jù)農(nóng)藥殘留色相圖譜， 快速準(zhǔn)確的識(shí)別不同類型的殘留農(nóng)藥。因此在后期的發(fā)展中，可采用建立農(nóng)藥殘留種類數(shù)據(jù)庫的方式， 用于存儲(chǔ)檢測(cè)的多種殘留色素圖譜，以此快速識(shí)別目標(biāo)農(nóng)藥，根據(jù)茶葉中含有的組合農(nóng)藥，進(jìn)行茶葉生產(chǎn)與施藥改良，以此提升茶產(chǎn)品的質(zhì)量，確保優(yōu)質(zhì)茶葉流入市場(chǎng)，在保障我國農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易衛(wèi)生質(zhì)量安全的前提下， 對(duì)不同農(nóng)藥進(jìn)行快速、精準(zhǔn)檢測(cè)。