納米中空氧化錫載非洛地平推拉式雙層滲透泵片的制備

胥智銘，高宇，吳超

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；3.撫順市中心醫(yī)院，遼寧 撫順 113000)

高血壓是心血管疾病最主要危險因素，其發(fā)病率逐年升高且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化的趨勢，已成為全球不可輕視的重大公共衛(wèi)生問題[1-2]。非洛地平(felodipine,FDP)是一種二氫吡啶類鈣離子通道拮抗劑，其降壓作用平穩(wěn)，對各期高血壓療效明顯，不良反應(yīng)少，目前在臨床上被重點關(guān)注。但非洛地平屬于BCSⅡ類藥物，即水溶性差，滲透性高?？诜锹宓仄诫y以被機體吸收，生物利用度低[3-4]。開發(fā)新型藥物遞送系統(tǒng)既提高非洛地平的水溶性和溶出速度同時調(diào)控藥物釋放速率維持長期穩(wěn)定血藥濃度，對于提高非洛地平的安全性、有效性以及患者的順應(yīng)性,使其在臨床上發(fā)揮更大的作用至關(guān)重要。近年來，納米材料解決難溶性藥物溶出速率而增加機體對藥物口服吸收備受青睞[5-6]。但納米材料僅成功地解決了難溶性藥物溶出速率的問題，未能改善藥物吸收后不可控的釋放引起的血藥濃度的峰谷現(xiàn)象。而滲透泵技術(shù)[3-4,7-8]298-305，823-829是以滲透壓差為驅(qū)動力，釋藥速率符合零級釋藥動力學(xué)特征，且釋藥行為不受環(huán)境(pH值、食物及胃腸道蠕動)等因素影響。本研究中利用納米材料中空氧化錫作為藥物載體，然后制備推拉式雙層滲透泵片，提高非洛地平的口服生物利用度。

1 儀器與材料

KSXL-1002馬弗爐(杭州卓馳儀器有限公司)，JEM-1010透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)，BT-Zeta100型納米粒度分析儀(丹東百特儀器有限公司)，IRAffinity-1紅外光譜儀，HS-DSC-101差示掃描量熱儀(上海和晟儀器科技有限公司)，ZEISS LSM 700激光共聚焦顯微鏡(上海萊瑟光譜儀器分析技術(shù)有限公司)，TDP型單沖壓片機(上海第一制藥機械廠)，RC806D溶出試驗儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)，UV-9100型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，LC-2030 高效液相色譜儀(日本島津公司)。

非洛地平(武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司，批號：140220)，二氯化錫、氯化鋅、十二烷基硫酸鈉、醋酸纖維素(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(色譜純，天津光復(fù)精細化工有限公司)，溴化鉀(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、聚環(huán)氧乙烷(分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司),非洛地平緩釋片(合肥立方制藥股份有限公司，批號：191006)、Hoechst 33342，羅丹明鬼筆環(huán)肽，異硫氰酸熒光素(FITC)(北京鼎國昌盛生物科技有限公司)、其余制劑均為市售分析純。

2 實驗方法

2.1 HMSn-FDP的制備

2.1.1 HMSn的制備[9-11]

取0.35 g SnCl2·2H2O、0.14 g ZnCl2、0.04 g NaOH和40 mL去離子水置于錐形瓶，攪拌2 h至混合均勻，將2 nmol/L NaOH溶液20 mL緩慢滴加至混合溶液，攪拌1 h，離心，沉淀物經(jīng)水洗、醇洗3次后干燥。干燥產(chǎn)物在650 ℃空氣氛圍下煅燒5 h后得到白色產(chǎn)物，在室溫條件下將白色產(chǎn)物加入20%氫氟酸溶液中攪拌分散30 min后離心，白色產(chǎn)物經(jīng)水洗3次后干燥，最后收集干燥產(chǎn)物，即得中空二氧化錫納米粒(HMSn)。

2.1.2 載藥

采用吸附法進行載藥。取800 mg FDP溶于1 mL二氯甲烷中，加入100 mg HMSn超聲至分散均勻后攪拌過夜。離心，得到沉淀物干燥，即得HMSn-FDP。精密稱取5.0 mg HMSn-FDP置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度。靜置1 h，離心，取上清液為供試品，在237 nm下測定吸光度并計算載藥量。載藥量=測得FDP的量/HMSn-FDP的量×100%

2.2 表征

2.2.1 TEM HMSn的形態(tài)結(jié)構(gòu)通過JEM-1010透射電子顯微鏡觀察，檢測電壓為200 kV。

2.2.2 DSC FDP在HMSn-FDP中存在狀態(tài)通過差示掃描量熱法在氮氣氛圍下檢測，溫度范圍為(50～300)℃，掃描速率10 ℃/min，繪制DSC曲線。

2.2.3 FTIR對FDP、HMSn-FDP及HMSn和FDP的物理混合物通過紅外光譜儀進行檢測

掃描波數(shù)為(400～4000)cm-1，KBr為空白。

2.3 HMSn腸道分布實驗

首先采用 FITC對HMSn進行標記得到FITC-HMSn。取220 g雄性SD大鼠，實驗前禁食12 h，將FITC-HMSn經(jīng)口服給藥(10 mg/kg)，2 h后處死，取十二指腸、空腸和回腸各1 cm段，經(jīng)4%多聚甲醛固定4 h，轉(zhuǎn)移至15%、20%、30%蔗糖水溶液進行脫水處理。取適量OCT包埋劑浸沒組織處理后進行冷凍切片，取8 μm組織切片置于載玻片上。經(jīng)PBS洗3次后，室溫下4%多聚甲醛固定。然后PBS洗3次，在4 ℃下，用0.1% 的Triton X-100 孵育10 min。在37 ℃下1%白蛋白封閉液封閉30 min后染色。采用Hochst 33342和羅丹明鬼筆環(huán)肽染色對切片染色。染色結(jié)束PBS洗3次后封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察各組切片。

2.4 HMSn-FDP體外溶出實驗

按照《中華人民共和國藥典》2020版釋放度測定法第二法，考察HMSn-FDP在規(guī)定條件下的溶出速率和程度。溶出介質(zhì)為1.0% SDS水溶液，溫度為37.0 ℃，轉(zhuǎn)速為100 rpm。精密稱量相當于5.0 mg FDP 的HMSn-FDP分散于500 mL溶出介質(zhì)。投藥后按預(yù)定時間 5、10、15、20、30、45、60、120 min取樣4 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過為供試品，取樣后補充等量空白釋放介質(zhì)。供試品在237 nm下測定吸光度并計算FDP累計溶出度。

2.5 HMSn-FDP滲透泵片的制備[3-4,12]298-305，823-829

2.5.1 滲透泵片芯制備

采用粉末直接壓片法制備滲透泵片芯，片芯包括藥物層和助推層兩部分，處方見表1。分別稱取處方量藥物層和助推層的原輔料，過80目篩，以等量遞加法混合均勻；采用雙層壓片技術(shù)壓制片徑為6 mm的滲透泵片芯。

表1 HMSn-FDP滲透泵片處方

2.5.2 包衣與打孔

取處方量醋酸纖維素溶于丙酮，加入處方量PEG水溶液，持續(xù)攪拌4 h混合均勻即得包衣液。將制備滲透泵片芯置于包衣鍋內(nèi)進行包衣，轉(zhuǎn)速為35 rpm，溫度為50 ℃，待包衣增重至合格后，轉(zhuǎn)移至40 ℃烘箱內(nèi)干燥24 h。取出干燥后的包衣片，采用打孔針在藥物層和助推層的中央各打一釋藥小孔，孔徑為0.8 mm。

2.6 HMSn-FDP滲透泵片的體外釋放度考察

按照《中華人民共和國藥典》2020版釋放度測定法第二法，比較HMSn-FDP滲透泵片和市售FDP緩釋片在規(guī)定條件下的體外釋放度。溶出介質(zhì)為1000 mL的0.1% SDS水溶液，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 rpm。于0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h取樣5 mL，取樣后立即補充的等量新鮮介質(zhì)，樣品0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，在 237 nm下測定吸光度并計算FDP的累積釋放度。

2.7 HMSn-FDP滲透泵片的體內(nèi)藥物動力學(xué)實驗

將12只體重為2.5 kg的健康家兔隨機分為兩組，禁食12 h。家兔經(jīng)口服給予HMSn-FDP滲透泵片或FDP緩釋片，劑量為10 毫克/只。給藥后分別于0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h經(jīng)耳緣靜脈取血3 mL，置于含有肝素的EP管中，離心，取上層血漿。取1 mL 血漿樣品置于10 mL 離心管中，加入20 μL尼群地平內(nèi)標溶液(1 ppm)，4 mL 乙酸乙酯和300 μL NaOH水溶液(1 M)，渦旋10 min，離心，取上清液，40 ℃揮干，使用50 μL流動相復(fù)溶，渦旋5 min，離心，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液，經(jīng)HPLC測定血漿中FDP的濃度并繪制血藥濃度-時間曲線和計算相關(guān)體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 HMSn-FDP的制備

HMSn-FDP的合成流程圖如圖1所示。本研究采用自模板法利用共沉淀反應(yīng)合成具有立方籠式結(jié)構(gòu)的ZnSn(OH)6，然后利用酸蝕、煅燒的技術(shù)獲得具有中空立方籠式結(jié)構(gòu)SnO2納米粒(HMSn)。最后采用吸附法將FDP負載到HMSn的中空結(jié)構(gòu)中獲得HMSn-FDP。經(jīng)UV測定HMSn-FDP載藥量為(31.73±2.26)%。

圖1 HMSn-FDP制備流程示意圖

3.2 表征

通過TEM對HMSn的形貌結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果如圖2A所示。HMSn是呈單分散狀態(tài)的內(nèi)部中空的立方體式核殼結(jié)構(gòu)，粒徑約為230 nm。HMSn的殼層表面晰地可見高度有序的介孔結(jié)構(gòu)，核心的中空結(jié)構(gòu)可為藥物貯庫。負載于中空結(jié)構(gòu)中的難溶性藥物FDP因納米空間限制效應(yīng)可導(dǎo)致藥物的溶解度和溶出速率顯著增加。通過DSC對藥物FDP在HMSn中的晶型狀態(tài)進行表征，結(jié)果如圖2B所示。HMSn的DSC曲線未見任何吸熱峰，F(xiàn)DP、 HMSn和原料藥FDP的物理混合物(PM)的DSC曲線中均在145 ℃出現(xiàn)的吸熱熔融峰表明FDP處于高度的結(jié)晶狀態(tài)，而HMSn-FDP的DSC曲線中FDP吸熱熔融峰的消失表明藥物負載于HMSn中的FDP的晶型發(fā)生了改變，可能是形成無定型物質(zhì)。無定型的固態(tài)藥物的自由能低，其溶出速率高于穩(wěn)定的晶態(tài)物質(zhì)。通過FT-IR鑒定藥物FDP 和 HMSn 之間是否發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。HMSn-FDP與HMSn和原料藥FDP的物理混合物(PM)與FDP的紅外光譜圖無明顯差異，未見新峰及任何峰的遷移，表明HMSn與FDP 未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，F(xiàn)DP是以物理吸附的形式負載于HMSn的中空結(jié)構(gòu)。

A B C

3.3 HMSn腸道分布

通過共聚焦顯微鏡CLSM觀察FITC-HMSn在大鼠小腸中的分布情況，結(jié)果如圖3所示。大鼠小腸各個節(jié)段(十二指腸、空腸和回腸)的腸上皮細胞的細胞質(zhì)中可見大量的呈現(xiàn)綠色熒光的FITC-HMSn。HMSn經(jīng)口服后能夠快速被腸道攝取，更有利于促進FDP的吸收，提高FDP的生物利用度。

圖3 FITC-HMSn在大鼠小腸各個節(jié)段中的激光共聚焦圖像

3.4 HMSn-FDP和HMSn-FDP雙層滲透泵片劑的體外溶出度

通過體外溶出度實驗考察HMSn改善FDP溶出速率和程度，結(jié)果如圖4A所示。FDP原料藥在60 min的溶出度僅為(24.53±2.13)%，而HMSn-FDP則高達(92.06±3.57)%，表明HMSn能顯著提高FDP的溶出速率。對比市售緩釋片與HMSn-FDP雙層滲透泵片在1% SDS水溶液中的體外釋放度，結(jié)果如圖4B所示。市售緩釋片中FDP在6 h基本完全釋藥，而HMSn-FDP雙層滲透泵片在12 h內(nèi)幾乎維持恒定的釋藥速率。將二者的累積釋放度進行零級動力學(xué)釋藥方程、一級動力學(xué)釋藥方程、Higuchi 釋藥方程數(shù)據(jù)擬合，市售緩釋片的釋放行為更符合一級模型(R22= 0.9638)，HMSn-FDP雙層滲透泵片的釋放方式符合零級模型(R12=0.9964)。

A B C

3.5 HMSn-FDP雙層滲透泵片的體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)測定

HMSn-FDP雙層滲透泵片和市售緩釋片在家兔體內(nèi)血藥濃度-時間曲線結(jié)果如圖4C所示，家兔口服HMSn-FDP雙層滲透泵片和市售緩釋片相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果如表2所示。與市售緩釋片相比，HMSn-FDP雙層滲透泵片的Tmax延長約2倍，Cmax僅為市售緩釋片的(72.96±0.61)%，AUC0-∞明顯升高，經(jīng)計算HMSn-FDP雙層滲透泵片的口服生物利用度提高了(121.32±0.52)%。

表2 家兔口服HMSn-FDP雙層滲透泵片和市售緩釋片相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)

4 結(jié) 論

本研究采用納米材料HMSn作為FDP的藥物載體，HMSn可顯著提高難溶性藥物FDP的溶解度和溶出速度，并且HMSn經(jīng)口服后能夠快速被腸道攝取，促進FDP經(jīng)口服的吸收。滲透泵技術(shù)有效調(diào)控FDP的釋放速率，使血藥濃度在較長時間維持在治療窗范圍內(nèi)，避免血藥濃度的峰谷現(xiàn)象，提高難溶性藥物FDP的生物利用度并減少不良反應(yīng)。綜上所述，納米材料聯(lián)合控釋技術(shù)構(gòu)建高生物利用度新型遞送系統(tǒng)是提高BCS II類藥物的生物利用度一種有效制劑手段。