SPAG9在膀胱癌細胞表達及其對膀胱癌細胞增殖凋亡的影響①

王 博，羅 斌，贠艷艷

(1.洛陽市第一人民醫(yī)院泌尿外科，河南 洛陽 471000;2.洛陽市第一人民醫(yī)院NMICU，河南 洛陽 471000)

膀胱癌是一種常見的發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是人體常見的十大腫瘤之一。在我國，膀胱癌已經(jīng)成為泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率高居第一位的疾病[1]。膀胱癌發(fā)病人群廣泛，可發(fā)生于任何年齡段的人群，甚至兒童也會發(fā)病，其發(fā)病率隨著年齡的增長而提高，高發(fā)病人群主要集中在50～80歲，其中男性發(fā)病率是女性的4倍左右。其常見癥狀是上尿路阻塞、排尿困難、膀胱刺激癥、血尿等。目前，主要治療手段是膀胱切除術(shù)、放療和化療等，但是患者治療和預(yù)后效果仍不佳。部分研究人員研究發(fā)現(xiàn)，精子相關(guān)抗原9(Sperm-associated antigen 9，SPAG9)在正常人體中曲細精管精子表達具有特異性[2]。SPAG9是一種最近幾年研究發(fā)現(xiàn)的腫瘤睪丸抗原，其主要參與調(diào)節(jié)再生過程中細胞信號的傳導(dǎo)。研究表明，SPAG9在肺癌、宮頸癌、乳腺癌等惡性腫瘤血清或組織中異常表達，這表明，SPAG9可能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。但是鮮有對SPAG9在膀胱癌細胞表達情況和作用機制進行研究，本次研究采用平行實驗，主要檢測SPAG9在膀胱癌患者腫瘤細胞中的表達情況，重點觀察研究腫瘤細胞的增殖凋亡，為全面了解和治療膀胱癌提供新的依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018-06～2019-12本院接診治療的126例膀胱癌患者為研究對象，年齡40～75歲，平均(64.32±7.81)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會審理批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：膀胱癌患者[4]；無精神病者；患者未患有腎衰竭等疾??；同意參加本次研究；入本院之前未進行其他治療；無過敏體質(zhì)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：病歷資料不全者；中途退出研究的；放棄治療者；無法參與研究的。

1.2 研究方法

采集患者RT4、J28、T24膀胱癌細胞系和膀胱上皮細胞SV-HUC-1。RT4細胞放置于常州德燁化工有限公司生產(chǎn)的含體積分數(shù)10%胎牛血清的Gibco mccoy's 5a 培養(yǎng)基培養(yǎng)。J28、T24細胞置于含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。SV-HUC-1置于美嵐實業(yè)(上海)有限公司生產(chǎn)的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均放置于上海知閔儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)的培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度37℃，二氧化碳濃度為5%，培養(yǎng)過程中收集對數(shù)期細胞。

采用定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)法檢測SPAG9 mRNA表達：SPAG9下游引物5’-TAAGTTGATGACCCATTATTAACCA-3’，上游引物5’-ATGTCCATAATTATATGGAACATTTA-3’，β-actin下游引物5’-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3’，上游引物5’-CCTCGCCTTTGCCGATC-3’。每孔細胞中加入浙江康德藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)的TRIZOL總RNA抽提試劑，然后放置于冰上5min，即可提取總RNA。提取總RNA5μg，在65℃條件下冰浴3min，變性10min，使用美嵐實業(yè)(上海)有限公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，-20℃保存。使用常州德燁化工有限公司生產(chǎn)的寶生物染料法熒光定量試劑盒以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，參照β-actin，在94℃條件下預(yù)變性4min，94℃條件下變性30s，56℃條件下變性30s，72℃條件下變性30s，循環(huán)40個，重復(fù)3次。使用2-△△Ct法計算SPAG9的相對表達量。

采用Western blot法檢測SPAG9蛋白表達水平：將培養(yǎng)基棄去，加入江蘇方強制藥廠有限責(zé)任公司生產(chǎn)的蛋白裂解液，5min冰浴，離心后得到上清液，提取2μL測定其濃度。剩余蛋白樣品加入福建古田藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的5*蛋白上樣緩沖液，煮沸5min，提取40μg樣品置于上樣孔中，設(shè)置壓力為80V，電泳，然后調(diào)整壓力為120V，在300mA條件下轉(zhuǎn)膜150min，將聚偏氟乙烯膜置于5%濃度的奶粉溶液中，孵育2h，加入吉林省康鈺藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的一抗，在4℃條件下孵育，漂洗后加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光液，使用上海修遠儀器儀表有限公司生產(chǎn)的凝膠成像儀進行分析，使用BCA蛋白濃度檢測法測定蛋白質(zhì)灰度值。

將T24細胞穩(wěn)定傳代后轉(zhuǎn)染。將該細胞分為3組：siRNA-SPAG9組(正常轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)染無義組(轉(zhuǎn)染失敗)和對照組(不作處理)。轉(zhuǎn)染開始前1d，每孔3×105個細胞，轉(zhuǎn)染開始前6h將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。將siRNA放置于無血培養(yǎng)基，室溫條件下孵育10min，每孔均加入孵育后復(fù)合物，37℃條件下孵育6h，然后使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用Western blot法和定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)法檢測SPAG9表達情況。

MTT比色法檢測細胞增殖：每孔接種5×103個細胞，轉(zhuǎn)染，使用上海修遠儀器儀表有限公司生產(chǎn)的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，加入MTT20μL，在37℃條件下培養(yǎng)4h，棄去上清液，加入二甲基亞砜100μL，在避光條件下振蕩20min，記錄細胞490nm時的吸光值。

采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率：轉(zhuǎn)染2d后，使用西安立邦制藥有限公司生產(chǎn)的無菌磷酸鹽清洗，濃度調(diào)整為1×105/mL，加入緩沖液，培養(yǎng)孔加入Annexin V5μL，在室溫條件下孵育15min，然后加入碘化丙啶5μL，使用南京大學(xué)普陽科學(xué)儀器研究所生產(chǎn)的流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄RT4、J28、T24膀胱癌細胞系和膀胱上皮細胞SV-HUC-1中SPAG9mRNA及蛋白表達情況、轉(zhuǎn)染后T24細胞SPAG9表達情況、細胞490nm時的吸光值和細胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SPAG9表達情況

RT4、J28、T24細胞中SPAG9 mRNA及蛋白表達均高于SV-HUC-1細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，RT4、J28細胞中SPAG9 mRNA及蛋白表達均低于T24細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 SPAG9表達情況分析

siRNA-SPAG9組、轉(zhuǎn)染無義組和對照組細胞中SPAG9 mRNA及蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且siRNA-SPAG9組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后T24細胞中SPAG9表達情況分析

2.3 膀胱癌細胞增殖結(jié)果分析

siRNA-SPAG9組(n=42)、轉(zhuǎn)染無義組(n=42)和對照組(n=42)細胞490nm吸光值分別為0.56±0.03、1.26±0.22、1.23±0.12，整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.116，P=0.005)，siRNA-SPAG9組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.537，P=0.011)。

2.4 膀胱癌細胞凋亡結(jié)果分析

siRNA-SPAG9組(n=42)、轉(zhuǎn)染無義組(n=42)和對照組(n=42)細胞凋亡率分別為(17.89±2.13)%、(5.86±0.71)%、(6.25±0.74)%，整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.031，P=0.000)，siRNA-SPAG9組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.351，P=0.007)，見圖1。

圖1 膀胱癌細胞凋亡結(jié)果分析

3 討論

據(jù)研究人員統(tǒng)計，膀胱癌手術(shù)治療后往往發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率較低，手術(shù)及放化療費用高，給患者及其家庭帶來巨大的心理壓力和經(jīng)濟壓力[5]。所以找到一種治療膀胱癌的靶向物質(zhì)，能夠使醫(yī)護人員更好的了解治療膀胱癌顯得尤為重要。SPAG9是目前人們用來研究膀胱癌的較為有效的一種抗原，在腫瘤細胞的增殖和癌基因的表達調(diào)控方面有重要作用[6]。早期研究人員認為，SPAG9只表達于人體睪丸組織細胞中，在人體正常組織中無表達[7]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和醫(yī)學(xué)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，SPAG9在惡性腫瘤患者血清和腫瘤組織中發(fā)揮著重要的免疫作用[8]。鑒于膀胱癌在我國患病人群數(shù)量巨大、發(fā)病率高、治療難度大，所以更應(yīng)加大SPAG9在膀胱癌細胞表達情況以及與細胞增殖凋亡的關(guān)系研究，早日找到治療膀胱癌的方法[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，SPAG9能夠與人體內(nèi)多種蛋白和細胞因子結(jié)合，可以激活細胞中大量的信號通路，參與人體多項生理活動，與人體部分器官和臟器疾病的發(fā)生，特別是惡性腫瘤的增殖凋亡關(guān)系密切[10]。所以，SPAG9極有可能是一種在惡性腫瘤治療方面具有重要作用的生物靶點。本次研究發(fā)現(xiàn)，RT4、J28、T24細胞中SPAG9 mRNA及蛋白表達均高于SV-HUC-1細胞，RT4、J28細胞中SPAG9 mRNA及蛋白表達均低于T24細胞，這表明SPAG9表達水平不同與膀胱癌疾病的發(fā)展程度有著重要的關(guān)系。大量研究表明，研究腫瘤細胞的增殖凋亡對提高治療效果，降低患者治療費用有重要作用。惡性腫瘤細胞的增殖是腫瘤疾病發(fā)展的重要標(biāo)記。多種細胞通路和細胞因子與腫瘤細胞增殖關(guān)系密切。本次研究發(fā)現(xiàn)，siRNA-SPAG9組、轉(zhuǎn)染無義組和對照組細胞中SPAG9 mRNA及蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且siRNA-SPAG9組明顯低于對照組，這表明SPAG9在膀胱癌疾病診斷中發(fā)揮重要的生物學(xué)特性作用。大量研究人員研究發(fā)現(xiàn)，SPAG9與除了膀胱癌之外的眾多惡性腫瘤細胞的增殖和凋亡有重要關(guān)系。SPAG9在肺癌血清及組織中異常表達可以作為診斷肺癌的重要手段。本次研究發(fā)現(xiàn)，siRNA-SPAG9組、轉(zhuǎn)染無義組和對照組細胞490nm吸光值整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，siRNA-SPAG9組明顯低于對照組，siRNA-SPAG9組、轉(zhuǎn)染無義組和對照組細胞凋亡率整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，siRNA-SPAG9組明顯高于對照組，這和部分人員的研究結(jié)果基本一致[11]。這說明，SPAG9可以調(diào)控膀胱癌腫瘤細胞的增殖和凋亡，這對于治療膀胱癌具有重大意義。

綜上所述，SPAG9 mRNA及蛋白在膀胱癌細胞中高水平表達，與膀胱癌細胞增殖凋亡密切相關(guān)，但是本次研究結(jié)果有局限性，參與研究患者數(shù)量少，所以尚需進一步研究。