4種內(nèi)源真菌對馬尾松凋落葉分解的影響

李慧業(yè)，林永慧，何興兵

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

【研究意義】森林是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最大的有機(jī)碳庫，在全球的碳氮循環(huán)過程發(fā)揮重要作用，而森林生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分歸還的主要途徑是凋落物分解[1]，凋落物的生產(chǎn)與分解過程會直接影響陸地的碳儲量和大氣中二氧化碳的濃度[2]。一般森林生態(tài)系統(tǒng)凋落物的主要成分為凋落葉，因此研究凋落葉的分解對了解森林生態(tài)系統(tǒng)功能過程中具重要意義。作為森林生態(tài)系統(tǒng)的基本成分，微生物是森林凋落物的主要分解者和還原者，直接參與了凋落物和土壤的生物化學(xué)過程[3-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，微生物對凋落葉的分解影響受到關(guān)注，真菌、放線菌和細(xì)菌是森林養(yǎng)分循環(huán)過程中重要的分解者，在植物凋落物無機(jī)礦化過程中有著不可替代的作用[5]，尤其以腐生真菌的分解作用最為顯著，能夠分解果膠物質(zhì)、木質(zhì)素和纖維素等難分解物質(zhì)，然而最近的一些研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源真菌也參與了分解過程[6]，內(nèi)源真菌又稱植物內(nèi)生真菌，在其生命周期的某些階段棲息于內(nèi)部植物組織的真菌，但不會對宿主造成明顯的傷害[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著葉片凋亡，內(nèi)源真菌隨葉片凋落，其營養(yǎng)方式由共生轉(zhuǎn)向腐生，從而可能對后續(xù)的分解過程產(chǎn)生了一定的影響。作為一種先鋒殖民者存在于植物種并無處不在[8]，與土壤中土著微生物相比，內(nèi)源真菌對纖維素的利用具有明顯優(yōu)勢[9]，內(nèi)源真菌參與凋落物分解過程中優(yōu)先于腐生真菌[10]，其高頻和資源優(yōu)先獲取能力可能很大程度上影響了凋落物分解過程[11]。它可以直接分解凋落物的有機(jī)成分，同時通過拮抗作用和微生物間的資源競爭，使內(nèi)源真菌與腐生菌相互作用，從而影響凋落物分解過程[12]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，研究馬尾松葉優(yōu)勢內(nèi)源真菌成員的表現(xiàn)和評估它們對分解凋落物的影響應(yīng)該具有重要生態(tài)學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 研究樣地

吉首大學(xué)(吉首校區(qū))后山馬尾松林，該區(qū)為亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，馬尾松 (Pinusmassoniana)是重要的用材樹種，也是荒山造林的先鋒樹種，經(jīng)濟(jì)價值高，用途廣，其凋落葉具有較高木質(zhì)素含量。

1.2 實(shí)驗設(shè)計

1.2.1 PDA培養(yǎng)基 2 %瓊脂，20 %土豆煮浸液，1 %葡萄糖。

1.2.2 樣品采集 將尼龍網(wǎng)懸掛空中，在落葉季節(jié)收集24 h內(nèi)新凋落的馬尾松葉，戴無菌手套收集于滅菌試管中，在同一地點(diǎn)收集3個試管，同一林型隨機(jī)選取5個地點(diǎn)進(jìn)行采樣。樣品2 h內(nèi)帶回實(shí)驗進(jìn)行消毒后進(jìn)行真菌分離。

1.2.3 分離方法 對新采集的凋落葉進(jìn)行表面消毒：在超凈工作臺，75 %的酒精浸洗3 min，在0.1 %的HgCl中浸泡15 min，再用75 %酒精中浸洗30 s后葉片，用無菌水沖洗5次。將表面消毒的馬尾松針葉用無菌手術(shù)刀切成0.5 cm的小段，用無菌鑷子置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(剖開面接觸培養(yǎng)基)，每個培養(yǎng)皿放5～7片。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d，等切口長出菌后把從切口長出的菌接種于虎紅培養(yǎng)基上再進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察菌落型態(tài)并拍照以確定型態(tài)型(根據(jù)顏色、生長速率、外觀型態(tài)等)，將確定的型態(tài)型進(jìn)行液體(PDB，即無瓊脂PDA進(jìn)行搖瓶培養(yǎng))擴(kuò)大培養(yǎng)后送羅寧生物科技有限公司進(jìn)行測序，獲得的真菌序列與GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對鑒定。

1.2.4 分解實(shí)驗 選擇4種優(yōu)勢內(nèi)源真菌，分別接種至新鮮的馬尾松凋落葉(4個單菌種樣品，兩兩組合6個混合菌種樣品，1個對照組)：采集24 h內(nèi)凋落的馬尾松葉，稱取3 g共12組進(jìn)行輻射滅菌后放入滅菌的錐形瓶中，用PDB培養(yǎng)基制成內(nèi)源真菌菌懸液后用移液槍過量接種到放有凋落葉的錐形瓶中，將錐形瓶放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，待凋落葉上長出菌絲后將其放入尼龍網(wǎng)袋中于2018年1月轉(zhuǎn)移至實(shí)驗采樣樣方內(nèi)(11個處理組，每個處理組12個樣品共132袋)，分解期為1年，分別在2018年6月和2019年1月各取樣1次，每次66袋。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 干濕重測定 取回的樣品先稱量鮮重(濕重)，后置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，測定干重[13]。

1.3.2 CO2釋放量測定 稱取0.5 g凋落物置于滅菌的離心管，放進(jìn)裝有10 mL 0.5 g /L NaOH溶液的三角瓶中密封于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)48 h，然后用0.05和0.10 mol/L HCl進(jìn)行滴定[14]。

1.3.3 微生物活性測定 凋落物分解酶活性采用先提取粗酶液后用紫外可見分光光度計(T6-新世紀(jì)) 測定酶活性的方法: 稱取1.5 g用30 mL 0.2 mol /L pH 4.8的醋酸緩沖溶液研磨2 min，然后在4 ℃下4000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min取上清液作為纖維素酶酶提液，其酶活性分析采用二硝基水楊酸法[15-16]。稱取2 g凋落物加60 mL 0.02 mol /L pH 5.0的醋酸緩沖溶液研磨2 min，4 ℃下4000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液作為木質(zhì)素酶提液，其酶活性分析用鄰聯(lián)甲苯胺法測定[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用WPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。對分解前后兩時期不同處理之間的變量進(jìn)行方差分析(采用Duncan多重比較法分析兩兩之間的差異性，顯著性水平設(shè)定為α=0.05) 。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源真菌多樣性

2017年10月進(jìn)行內(nèi)源真菌的分離，共有內(nèi)源真菌繁殖體194株，根據(jù)顏色、生長速率、外觀形態(tài)分為17種形態(tài)型(PM01-PM17)進(jìn)行PDB擴(kuò)大培養(yǎng)得到菌絲進(jìn)行鑒定，表1和圖1分別為17種內(nèi)源真菌豐富度表和17種內(nèi)源真菌ITS序列分析系統(tǒng)發(fā)育樹。

從表1和圖1中可知，PM01(Xls)與炭角菌屬相似度為100 %，可確定為炭角菌屬；PM03(Pn)與擬盤多毛孢屬相似度為87 %，可確定為擬盤多毛孢菌屬；PM07(Pc)與葉點(diǎn)霉菌屬相似度為100 %，可確定為葉點(diǎn)霉菌屬；PM09(Ab)與褐傘殘孔菌屬相似度為99 %，可確定為褐傘殘孔菌屬。其中PM04、PM08、PM11和PM12是同種菌種，PM16和PM17是同種菌種。實(shí)驗以最高豐富度篩選出PM01、PM04、PM07、PM09作為優(yōu)勢菌中進(jìn)行分解實(shí)驗，但在后期培養(yǎng)過程中由于PM04菌種生長緩慢且不易存活，所以以PM03菌種替換。

2.2 內(nèi)源真菌對凋落物失重率的影響

如表2所示，短期內(nèi)分解時對照組的失重率高于大部分處理組，而Xls處理組的失重率最高，達(dá)12.75 %，Pc處理組失重率最低(表2，P<0.05)；Pc組、Xls組、Pn組和Ab組為單菌處理，其中Xls組和Pn組處理后的馬尾松凋落葉的失重率較高，其余兩組較低，Pc+Xls組、Ab+Pn組、Pn+Pc組、Ab+Xls組、Pn+Xls組和Ab+Pc組為單菌兩兩隨機(jī)組合成的混合菌處理且失重率都低于對照組(表2，P<0.05)。

表2 內(nèi)源真菌對馬尾松凋落葉失重率的影響Table 2 Effects of endophytic fungi on mass loss of P. massoniana litters

考慮到短期內(nèi)各內(nèi)源真菌處理組對凋落葉的分解有一定影響，所以進(jìn)行一年的野外實(shí)驗，抽樣次數(shù)為2次，180 d為分解前期，360 d為分解后期，前后期的失重率變化如圖2所示。在凋落物分解前期，單菌Pc組和Ab組的失重率低于對照組，而混合菌組均高于對照組；在凋落葉分解后期，單菌組與混合菌組的失重率成上升趨勢，單菌Xls組的失重率最低，且單菌組的失重率均低于混合菌組(圖2，P<0.05)，其中Ab+Pn組的失重率最高，達(dá)62.39 %，而單菌處理Xls組最低，為33.56 %，隨著時間的增加凋落葉的失重率均有升高趨勢(圖2，P<0.05)。

2.3 內(nèi)源真菌對凋落物分解CO2釋放量的影響

從表3中可知，各個處理組前期的CO2釋放量均高于后期且前期混合菌組的釋放量呈上升趨勢(表3，P<0.05)，其中Pc+Xls組最高，為1229.1 μmol/(g·d)，最低為Xls組722.2 μmol/(g·d)，在單菌處理中Pn組的釋放量為最高為1027.7 μmol/(g·d)；而分解過程在360 d后所有處理組的CO2釋放量呈下降趨勢，其中在混合菌處理的Ab+Xls組CO2釋放量最低為11.9 μmol/(g·d)，與前期相反的是對照組在分解后期CO2釋放量最高為272.2 μmol/(g·d)整體而言，隨著時間增加各處理的CO2釋放量呈下降趨勢(表3，P<0.05)。

表3 內(nèi)源真菌對馬尾松凋落物分解CO2釋放量的影響Table 3 Effects of endophytic fungi on CO2 release of P. massoniana litter decomposition [×102 μmol/(g·d)]

2.4 內(nèi)源真菌對凋落物分解酶活性的影響

凋落葉分解過程分解酶的參與是必不可少的，其中纖維素分解酶包括Cx酶、C1酶和β-葡萄糖苷酶。從圖4可知，不同處理組酶活性均不相同，分解前期，Pc+Xls組和Ab+Pn組的Cx酶活性最高，前者為371.97 μmol/(g·d)，Pn組酶活性最低，為48.64 μmol/(g·d)；在分解后期Pc+Xls組的酶活性仍然最高328.3 μmol/(g·d)，Pn+Xls組的酶活性最低只有4.74 μmol/(g·d)。整體來看前期單菌處理的酶活性均低于混合菌處理的酶活性，且混合菌呈上升趨勢(圖3，P<0.05)，但在后期Pn+Pc組、Ab+Xls組、Pn+Xls組和Ab+Pc組呈相反趨勢(圖3，P<0.05)。

分解前期Ab+Xls組C1酶酶活性最高為3.36 μmol/(g·d)；后期分解中與Cx酶相同的是Pc+Xls組和Ab+Pn組C1酶活性仍然最高，后者為6.22 μmol/(g·d)，單菌Ab組最低0.95 μmol/(g·d)，Pn+Pc組、Ab+Xls組、Pn+Xls組和Ab+Pc組酶活性均低于對照組且與前期呈相反趨勢(圖3，P<0.05)。

分解前期，Pn+Xls組和Pn+Pc組的β-葡萄糖苷酶酶活性較高，Ab+Pn組的β-葡萄糖苷酶酶活性最低；分解后期，Pc+Xls組和Ab+Pn組β-葡萄糖苷酶酶活性較高，其中后者的酶活性最高，整體呈下降趨勢(圖3，P<0.05)。

木質(zhì)素分解酶包括漆酶和過氧化物酶。在分解前期對照組的漆酶酶活性最高而后期呈下降趨勢(圖3，P<0.05)，其次是混合菌Pc+Xls組，但分解后期也呈下降趨勢，其中前期與后期分解過程中最為穩(wěn)定的是混合菌Pn+Xls組，其次為Ab+Pn組；分解前期單菌Xls組和Pn組的過氧化物酶較高，但在后期呈下降趨勢(圖3，P<0.05)，后期分解過程中單菌Pc組的過氧化物酶酶活性最高，與前期相比呈上升趨勢(圖3，P< 0.05)，整體而言后期過氧化物酶酶活性呈上升趨勢。

3 討 論

3.1 凋落物在分解過程中凋落物失重率與內(nèi)源真菌的關(guān)系

凋落物的分解過程被溫度、濕度、酸堿度、基質(zhì)和微生物等多種因素影響。而本實(shí)驗中的馬尾松含豐富的木質(zhì)素很難被微生物降解[18]。定殖后的馬尾松葉內(nèi)源真菌也可能是導(dǎo)致分解前后失重率出現(xiàn)差異的原因之一，在進(jìn)行野外實(shí)驗前馬尾松凋落葉進(jìn)行了120 d的自身降解實(shí)驗，實(shí)驗在短期的分解過程中內(nèi)源真菌對凋落物的分解有一定影響但效果并不明顯，然而野外環(huán)境和時間長短卻可以擴(kuò)大或縮小差異。炭角菌屬是一類極為常見的內(nèi)源真菌并存在于森林樹木的活葉的凋落葉中[19]，從葉片的腐敗程度來看炭角菌可分解木質(zhì)素，分解能力在分解葉柄時最高[20]。實(shí)驗中所選取的凋落物基本為新鮮的凋落葉，雖然炭角菌可分解木質(zhì)素但由于分解期較短導(dǎo)致后期分解過程中失重率最低；擬盤多毛孢菌屬是一種常見內(nèi)源真菌，對闊葉的分解能力高于針葉，在短期內(nèi)可能對針葉的分解率較低[21]，有纖維素分解酶，去木質(zhì)化的作用影響較小[22]，所以擬盤多毛孢菌前期擅長分解馬尾松凋落葉中的纖維素導(dǎo)致失重率比其他菌種高；有關(guān)于葉點(diǎn)霉屬分解凋落物的研究甚少，這是一種常見并廣泛的內(nèi)源真菌和植物弱病原體，研究發(fā)現(xiàn)葉點(diǎn)霉不會對健康葉片造成傷害和疾病[23]，在本實(shí)驗中其對馬尾松凋落葉的分解能力與褐傘殘孔菌相差無幾，后者作為白腐真菌屬的一種，可造成木材的白色腐朽[24]，所以可以分解木質(zhì)素。在混合菌處理組中擬盤多毛孢菌和褐傘殘孔菌混合菌處理組的失重率最高，其原因是因為前者在分解前期分解了部分纖維素而后者分解了部分木質(zhì)素，總體而言凋落葉失重率隨時間增長而增大，設(shè)置的混合菌處理組處理在分解后期均處于上升趨勢，意味著內(nèi)源真菌之間在可利用分解基質(zhì)充足的情況下會發(fā)生協(xié)同作用，各司其職進(jìn)行分解過程。

3.2 凋落物在分解過程中CO2釋放量的關(guān)系

CO2釋放量反映了作為凋落物的主要分解者微生物的代謝與生長狀況，在分解前期各處理組的CO2釋放量均較高，說明前期各內(nèi)源真菌新陳代謝迅速且活躍，混合菌組由于菌種之間由于生存空間及所需營養(yǎng)較多，菌種之間無過多競爭關(guān)系所以大部分混合菌處理組菌高于對照組和單菌處理組，而后期由于生存空間與營養(yǎng)物質(zhì)的減少并出現(xiàn)競爭關(guān)系各處理組的CO2釋放量下降，新陳代謝緩慢導(dǎo)致部分真菌死亡，其中擬盤多毛孢菌和褐傘殘孔菌混合菌處理組的CO2釋放量水平較平穩(wěn)，與其凋落葉失重率表現(xiàn)一致，表明微生物呼吸作用是分解過程中的主要驅(qū)動力，內(nèi)源真菌會影響凋落物對CO2釋放量的反應(yīng)機(jī)制與失重率相同且關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。

3.3 凋落物在分解過程中分解酶活性與內(nèi)源真菌的關(guān)系

纖維素和木質(zhì)素是凋落物的主要組分，木質(zhì)素是凋落物中最難被微生物分解的復(fù)合物[25]，而纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，相較于木質(zhì)素降解速率快[26]，兩者的生物分解是維持生態(tài)系統(tǒng)碳平衡和能量循環(huán)必不可少的過程之一[27]。凋落物分解酶是凋落物分解過程的主要參與者，凋落物分解酶的活性決定著分解的快慢[28]。雖然分解過程中會有很多酶參與，但最主要的酶是纖維素分解酶和木質(zhì)素分解酶，常可作為衡量凋落物分解速率的指標(biāo)[29]。

整體來看，所有的酶活性隨時間呈現(xiàn)上升趨勢，在分解過程中隨時間的增長擬盤多毛孢菌和褐傘殘孔菌混合菌處理組纖維素分解酶(C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶)在分解后期酶活性反應(yīng)均與失重率一致，馬尾松凋落葉中木質(zhì)素很難被降解，而擬盤多毛孢菌可分解纖維素，可產(chǎn)較多纖維素分解酶，導(dǎo)致在分解后期其處理組C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶酶活性較高。在分解后期單菌擬盤多毛孢菌處理組的纖維素酶酶活性沒有高于擬盤多毛孢菌和褐傘殘孔菌混合處理組的原因可能是菌種之間存在協(xié)同作用；漆酶和過氧化物酶主要參與木質(zhì)素的分解，在整個分解過程漆酶酶活性均顯示出與失重率密切的相關(guān)性，這表明漆酶對木質(zhì)素分解起重要作用，褐傘殘孔菌是一種白腐菌擅長分解木質(zhì)素，所以在分解后期漆酶酶活性較高，與擬盤多毛孢菌產(chǎn)生協(xié)同作用后會更有效更快速地分解凋落物，單菌褐傘殘孔菌處理組失重率不高的原因可能產(chǎn)纖維素分解酶較少，雖然可以分解木質(zhì)素但需要更久的時間。過氧化物酶在分解后期各個處理組之間沒有較大差異，說明過氧化物酶可能對底物有較高的選擇性并顯示過氧化物酶對酶解響應(yīng)可能有更為復(fù)雜的機(jī)理，所以凋落物分解過程中酶活性會因各種生物因素或非生物因素的影響而發(fā)生變化。

4 結(jié) 論

(1)馬尾松內(nèi)源真菌定殖對凋落物的分解有影響且單菌處理和混合菌處理均有影響，與對照組相比，分解360 d后，混合菌處理的失重率高于單菌處理，使得凋落物分解速率加快，表明不同的內(nèi)源真菌有不同的分解潛力，內(nèi)源真菌之間的相互作用也會導(dǎo)致分解速率的改變；凋落葉分解期CO2釋放量表明雖然在分解前期群落數(shù)量會占得優(yōu)勢并快速進(jìn)行新陳代謝，但分解后期由于分解底物減少使得CO2釋放量均低于對照組；由五種酶酶活性的數(shù)據(jù)表明，內(nèi)源真菌會影響分解酶從而影響分解速率，在失重率中可看出混合菌處理組對于酶活性影響較大，尤其是擬盤多毛孢菌和褐傘殘孔菌混合菌處理組在Cx酶、C1酶、β-葡萄糖酶和漆酶中的酶活性最穩(wěn)定，這也可以解釋在分解后期這組處理的失重率最高。

(2)4種內(nèi)源真菌單菌處理組與混合菌處理組之間的各個表現(xiàn)也出現(xiàn)差異，但對構(gòu)建混合菌群落的相關(guān)研究甚少，凋落物的分解是極其復(fù)雜且耗時的過程，其中參與分解的真菌細(xì)菌等微生物不計其數(shù)，模擬構(gòu)建微生物群落是有必要，這更有利于探究各種微生物對凋落物分解的影響，不同群落對不同基質(zhì)凋落物的影響也是需要進(jìn)一步分析與探究。