條紋病對(duì)不同抗性青稞品種生理特性的影響

楊 雪，姚曉華*，吳昆侖，姚有華，遲德釗*

( 1.青海大學(xué)，青海 西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院/青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家麥類改良中心青海青稞分中心，青海 西寧 810016)

【研究意義】青稞(Hordeumvulgarevar.coelesteL.)是青藏高原上的優(yōu)勢(shì)特色農(nóng)作物之一，屬于禾本科小麥族大麥屬，是大麥的變種，因其內(nèi)外穎殼分離，籽粒裸露，故又稱裸大麥、元麥、米大麥[1]。青稞具有加工食用，飼養(yǎng)牲畜，釀造青稞酒及藥用等多種用途[2]，因其籽粒含有較高蛋白質(zhì)、高纖維、高維生素 和較低的糖和脂肪(俗稱三高兩低)，得到了人們的關(guān)注[3]。在海拔4200 m以上高寒地帶，青稞是唯一能正常成熟的谷物[4]。在該種植區(qū)域由于連年種植，沒(méi)有進(jìn)行輪作，導(dǎo)致大面積發(fā)生條紋病[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】條紋病是大麥生產(chǎn)的一種主要的種傳病害，主要由麥類核腔菌Pyrenophoragraminea(無(wú)性態(tài)Drechsleragraminea)引起的，屬于真菌性病害[6]。條紋病具有存活時(shí)間久、危害重、分布范圍廣、傳播途徑多、難防治特點(diǎn)[7]，隨著感病等級(jí)的增加，谷物產(chǎn)量，分蘗數(shù)，粒重和物生物量都減少[8]，嚴(yán)重地影響了大麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[9]。條紋病在大麥種植國(guó)家及地區(qū)害普遍發(fā)生[10]；在我國(guó)，青稞發(fā)病較嚴(yán)重地區(qū)的死亡率可達(dá)30 %～40 %[11]。目前青稞條紋病的研究主要集中在發(fā)生和防治方向[12]，對(duì)青稞條紋病發(fā)生的生理機(jī)制的研究較少。【本研究切入點(diǎn)】本研究利用高抗病青稞品種“昆侖14號(hào)”，高感青稞品種“Z1141”為試驗(yàn)材料，通過(guò)檢測(cè)條紋病侵染的程中主要生理生化指標(biāo)的變化，揭示不同抗病青稞品種對(duì)條紋病生理響應(yīng)的差異?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】此研究不僅有助于了解青稞條紋病發(fā)生的生理機(jī)制，而且能為抗病資源的利用和培育抗病新品種奠定生理基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

抗病青稞品種的“昆侖14號(hào)”和感病青稞品種“Z1141”，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院作物栽培與育種研究所青稞研究室繁育保存。2019年4月在青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)2品種的各500粒種子進(jìn)行條紋病菌接種處理，同時(shí)設(shè)置不接種對(duì)照處理。后將2品種按“Z1141”對(duì)照、“Z1141”接種、 “昆侖14號(hào)”對(duì)照和“昆侖14號(hào)”接種順序條播，每處理種植5行，每行播種100粒，行長(zhǎng)2 m，田間管理同大田。待兩接種品種發(fā)病15 d后(發(fā)病初期)開(kāi)始分別在4個(gè)處理中取“Z1141”對(duì)照處理的葉片(Z1141C)、“Z1141”接種處理的葉片(Z1141T)、“昆侖14號(hào)”對(duì)照處理的葉片(KL14C)和“昆侖14號(hào)”接種處理的葉片(KL14T)樣品用于生理指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)樣品至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 嚴(yán)重度 利用籽粒、針葉圖像分析系統(tǒng)(REGRNT INSTRUMENTS INC)掃描并計(jì)算青稞葉片發(fā)病面積，并以不同抗性青稞品種的葉片感病面積占總面積的比例來(lái)表示發(fā)病嚴(yán)重度。

1.2.2 可溶性蛋白 利用生產(chǎn)的總蛋白定量試劑盒S045-3-2(南京建成生物工程研究所)測(cè)定。

總蛋白濃度(μg/mL)=測(cè)定(OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(563 g/mL)×測(cè)定前稀釋倍數(shù)

1.2.3 相對(duì)電導(dǎo)率 葉片的相對(duì)電導(dǎo)率參照譚常(1985)的測(cè)定方法測(cè)定[13]。

相對(duì)電導(dǎo)率=(浸泡電導(dǎo)率值/煮沸后電導(dǎo)率值)×100 %

1.2.4 脯氨酸 利用脯氨酸試劑盒A107-1-1(南京建成生物工程研究所)測(cè)定。

脯氨酸含量(μg/g組織濕重)=(測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5 μg/mL)/勻漿液濃度(g組織濕重/mL)×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

1.2.5 丙二醛 利用植物丙二醛試劑盒A003-3-1(南京建成生物工程研究所)測(cè)定。

丙二醛含量(nmol/g)=(測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/mL)/ 樣本濃度(g/mL)

1.2.6 相對(duì)葉綠素含量 相對(duì)葉綠素含量利用SPAD-502在發(fā)病后(約播種后30 d)上午11：00-12：00進(jìn)行測(cè)定，每5 d測(cè)1次，每葉片取上、中、下3個(gè)點(diǎn)分別測(cè)定1次，后取其平均值。

1.2.7 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定前葉片充分暗適應(yīng)30 min，利用Technologica cf Imager system(飽和脈沖光1000 μmol/m2/s、照射時(shí)間15 min)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。相關(guān)熒光參數(shù)如下所示：PSII潛在量子效率：Fv/Fm、光下開(kāi)放的PSII反應(yīng)中心的激發(fā)能捕獲效率：Fv′/Fm′、作用光存在時(shí)PSII實(shí)際的光化學(xué)量子效率：Fq′/Fm′，光化學(xué)淬滅系數(shù)：Fq′/Fv′，非光化學(xué)淬滅系數(shù)：NPQ。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin8.0繪制圖表、Stst2與Spss13進(jìn)行方差分析和多重比較分析(Duncan’s)。

2 結(jié)果與分析

2.1 條紋病對(duì)不同抗性青稞品種嚴(yán)重度的影響

由圖1可知，不同品種的葉片感病程度不同，“昆侖14號(hào)”的病葉產(chǎn)生淡黃色細(xì)長(zhǎng)條紋或斷續(xù)相連的條紋，而“Z1141”的病葉中間和邊緣出現(xiàn)黃褐色條紋，褐色發(fā)病部位的部分葉片干枯?？梢?jiàn)，感病品種“Z1141”發(fā)病嚴(yán)重度顯著高于抗病品種“昆侖14號(hào)”。

2.2 條紋病對(duì)不同抗性青稞品種葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是作物生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的成分，而且參與植物的滲透調(diào)節(jié)，因此可溶性蛋白含量可以作為一項(xiàng)生理指標(biāo)來(lái)反映植物生長(zhǎng)過(guò)程中的抗逆作用[14]。由圖2可知，抗病品種和感病品種條紋病侵染后葉片可溶性蛋白質(zhì)含量發(fā)生了不同的變化，其中抗病品種“昆侖14號(hào)”可溶性蛋白的含量比對(duì)照組葉片高19.35 %，兩者差異顯著(P<0.05)，而感病品種“Z1141”可溶性蛋白的含量比對(duì)照組葉片低37.13 %，兩者差異顯著(P<0.05)?？梢?jiàn)葉片可溶性蛋白在青稞條紋病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

2.3 條紋病對(duì)不同抗性青稞品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

相對(duì)電導(dǎo)率能反映植物在逆境下細(xì)胞膜的破損程度，可以作為一項(xiàng)生理指標(biāo)來(lái)顯示植物的抗病性[15]。由圖3可知，抗病品種和感病品種條紋病侵染后葉片后相對(duì)電導(dǎo)率變化發(fā)生了不同程度的升高，其中“昆侖14號(hào)”的相對(duì)電導(dǎo)率比對(duì)照組葉片高28.06 %，兩者差異顯著(P<0.05)；“Z1141”相對(duì)電導(dǎo)率比對(duì)照組葉片高94.48 %，兩者差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果可知，在條紋病脅迫下，“Z1141”葉片相對(duì)電導(dǎo)率上升的幅度顯著高于“昆侖14號(hào)”(P<0.05)。由此可見(jiàn)，葉片相對(duì)電導(dǎo)率在青稞條紋病發(fā)生過(guò)程中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

2.4 條紋病對(duì)不同抗性青稞品種葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是組成蛋白的成分之一，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透勢(shì)，維持滲透平衡，可以對(duì)條紋病脅迫作出響應(yīng)[16]。由圖4所知，抗病品種和感病品種條紋病侵染后葉片后脯氨酸的含量產(chǎn)生了不同程度的升高，其中“昆侖14號(hào)”脯氨酸含量是對(duì)照組葉片的7.6倍，兩者差異顯著(P<0.05)；“Z1141”脯氨酸含量是對(duì)照組葉片的10.8倍，兩者差異顯著(P<0.05)。同時(shí)， “Z1141”處理組脯氨酸含量顯著高于“昆侖14號(hào)”(P<0.05)。由此可見(jiàn)，葉片脯氨酸含量在青稞條紋病發(fā)生過(guò)程中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

2.5 條紋病對(duì)不同抗性青稞品種葉片丙二醛含量的影響

丙二醛可以反映植物遭受逆境對(duì)膜和細(xì)胞傷害的程度，可以作為抗性指標(biāo)來(lái)分析細(xì)胞受到脅迫的嚴(yán)重程度[17]。由圖5所知，抗病品種和感病品種條紋病侵染后葉片后丙二醛含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中“昆侖14號(hào)”丙二醛含量比對(duì)照組葉片高27.45 %，兩者差異顯著(P<0.05)；“Z1141”丙二醛含量比對(duì)照組葉片高78.07 %，兩者差異顯著(P<0.05)。同時(shí)，“Z1141”丙二醛含量顯著高于“昆侖14號(hào)”。由此可見(jiàn)，葉片丙二醛含量在青稞條紋病發(fā)生過(guò)程中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

2.6 條紋病對(duì)不同抗性青稞品種葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

植物葉片對(duì)光能的吸收和利用可以用葉綠素?zé)晒馓匦詠?lái)評(píng)價(jià)[18]。由圖6可知。感病品種和抗病品種條紋病發(fā)生后對(duì)葉片熒光參數(shù)產(chǎn)生了不同的影響，其中“昆侖14號(hào)”和“Z1141”的Fv/Fm分別下降了2.64 %和48.57 %；NPQ分別降低了1 %和26.70 %，F(xiàn)'q/F'v分別降低20.28 % 和 22.06 %，“昆侖14號(hào)”的F'v/F'm顯著增加了11.21 %，而“Z1141”的F'v/F'm降低了12.46 %；“昆侖14號(hào)”和“Z1141”的F'q/Fm分別減少6.92 %和8 %。由此可見(jiàn)，條紋病發(fā)生時(shí)，“Z1141”比“昆侖14號(hào)”對(duì)條紋病反應(yīng)更敏感。

2.7 條紋病對(duì)不同抗性青稞品種葉綠素含量的影響

由圖7可知，條紋病對(duì)不同抗性的青稞葉片的葉綠素含量產(chǎn)生了不同的影響，其中 “昆侖14號(hào)”未接種處理的葉綠素含量呈逐漸降低的趨勢(shì)， 6月6日比5月25日降了10.16 %，而“Z1141”葉綠素總含量呈逐漸增加的趨勢(shì)，6月6日比5月25日增加了5.77 %。接種處理的兩品種的葉綠素總含量隨著青稞的生長(zhǎng)發(fā)育均呈逐漸降低的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，6月6日“昆侖14號(hào)”葉綠素含量降低了63.79 %，而“Z1141”降低了82.91 %，“Z1141”葉綠素含量下降的值顯著高于“昆侖14號(hào)”(P<0.05)。由此可見(jiàn)，條紋病對(duì)葉綠素總含量影響較大。

3 討 論

植物受病原物侵染后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列的生理代謝變化，如蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、熒光、氨基酸等的含量都會(huì)發(fā)生變化，而這些變化與植物抗病性密切相關(guān)[19]。本研究結(jié)果表明，條紋病對(duì)不同抗性青稞品種葉片生理特性的影響不同。條紋病發(fā)生后，抗病品種的葉片可溶性蛋白含量顯著增高，而感病品種的可溶性蛋白的含量顯著降低，原因可能是當(dāng)條紋病發(fā)生初期，某些抗病相關(guān)蛋白大量表達(dá)，增強(qiáng)了葉片的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高其抗病性[20]；而感病品種的葉片可溶性蛋白自我調(diào)控能力差，病原菌的入侵直接影響蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)蛋白質(zhì)降解速度加快，導(dǎo)致葉片的蛋白質(zhì)含量下降。這一結(jié)果與郭陞垚等[21]研究的結(jié)果相似。

植物遭受逆境脅迫時(shí)，由于環(huán)境中滲透勢(shì)低，往往造成植物吸水困難。為了減少傷害，植物本身會(huì)合成一些可溶性物質(zhì)如脯氨酸來(lái)降低細(xì)胞滲透勢(shì)，利于從外界吸收水分[22]。本研究結(jié)果表明，“昆侖14號(hào)”和“Z1141”感病后脯氨酸含量均顯著增加，“Z1141”顯著高于“昆侖14號(hào)”，可能是脅迫初期，“昆侖14號(hào)”對(duì)條紋病忍耐程度較強(qiáng)，表型上受脅迫較輕，細(xì)胞功能較為正常，產(chǎn)生的脯氨酸含量與“Z1141”相比也較低。這一研究結(jié)果與魏崍等[17]對(duì)大豆的腐霉根腐病研究結(jié)果并不一致，他們的研究結(jié)果表明，在病害的脅迫下，抗病品種的脯氨酸含量增加量顯著高于感病品種，可能是品種抗性不同或病害強(qiáng)度不同等。另有研究表明，病害脅迫下引發(fā)植物膜脂過(guò)氧化，嚴(yán)重?fù)p傷了膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外滲，外滲率(相對(duì)電導(dǎo)率)和MDA含量的高低可以反映植物膜的傷害程度[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接菌后，2品種電導(dǎo)率、丙二醛含量顯著增加，“昆侖14號(hào)”增加幅度顯著低于“Z1141”，說(shuō)明感病品種的細(xì)胞膜功能受到嚴(yán)重的損傷，而抗病品種為了響應(yīng)條紋病脅迫，能及時(shí)做出應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞膜損傷程度較輕，此結(jié)果與蛋白質(zhì)和脯氨酸含量結(jié)果是一致的。

葉片作為植物響應(yīng)病害最敏感的部位，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理變化可直接反應(yīng)植物適應(yīng)和抵御脅迫的能力，而葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)[24]。本試驗(yàn)中條紋病發(fā)生后，2個(gè)品種葉片均出現(xiàn)黃色條斑，“Z1141”發(fā)病嚴(yán)重度顯著大于“昆侖14號(hào)”(圖1)；同時(shí)6月6日與5月25日相比，“昆侖14號(hào)”對(duì)照組葉片的相對(duì)葉綠素含量逐漸降低，處理組葉片的相對(duì)葉綠素含量顯著降低；而“Z1141” 對(duì)照組的相對(duì)葉綠素含量略有升高，處理組葉片相對(duì)葉綠素含量顯著降低，且“Z1141”葉綠素含量降低值顯著高于“昆侖14號(hào)”，原因可能前期是輕度病害脅迫，葉綠素通過(guò)生物合成來(lái)適應(yīng)環(huán)境的脅迫，后期病原菌破壞了葉綠體的結(jié)構(gòu)，葉綠素合成速度遠(yuǎn)小于降解速度，但抗病品種降解速度稍慢于感病品種[25]。另外，逆境脅迫不但會(huì)影響植物的葉綠素合成，還會(huì)影響正常的光化學(xué)反應(yīng)，PSⅡ比 PSⅠ更易受到環(huán)境脅迫的損傷，因此可用葉綠素?zé)晒鈪?shù)來(lái)反映植物的抗性作用[26]。條紋病發(fā)生后，PSII最大光化學(xué)效率Fv/Fm、光化學(xué)淬滅系數(shù)F'q/Fm、和PSII實(shí)際的光化學(xué)量子效率F'q/F'v都呈降低趨勢(shì)，且抗病品種下降幅度低于感病品種，可能是抗性品種“昆侖14號(hào)”在條紋病脅迫下PSII受到損傷程度輕于感病品種，光合電子傳遞下降速率減緩，使得最初電子受體QA氧化還原能力和光合碳同化能力維持在較高的水平[18]。PSII反應(yīng)中心的激發(fā)能捕獲效率F'v/F'm在“Z1141”顯著下降，說(shuō)明“Z1141”中的光能轉(zhuǎn)化率降低，光合機(jī)構(gòu)積累大量過(guò)剩光能，使得光合膜發(fā)生光氧化，導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)損傷，且“Z1141”的 NPQ顯著下降，說(shuō)明葉片熱耗散機(jī)制嚴(yán)重受損，又積累大量的激發(fā)能，使得植物葉綠體類囊體膜和光合復(fù)合體發(fā)生了變化，進(jìn)而導(dǎo)致植物光保護(hù)能力喪失，出現(xiàn)了如圖1中葉片感病部位的黃斑。但F'v/F'm在“昆侖14號(hào)”顯著升高，說(shuō)明在脅迫下光能轉(zhuǎn)化率升高，生物合成增多，進(jìn)而緩解逆境脅迫，且NPQ下降的不明顯[27-29]?？梢?jiàn)葉綠素?zé)晒馓匦栽诓煌箺l紋病青稞品種中也產(chǎn)生了差異響應(yīng)。

4 結(jié) 論

2個(gè)不同抗病性的青稞品種對(duì)條紋病脅迫產(chǎn)生了相似的響應(yīng)機(jī)制，即條紋病發(fā)生時(shí)葉片出現(xiàn)黃色條斑，細(xì)胞膜透性和脯氨酸含量增加，葉片光合系統(tǒng)受損等一系列變化。不同的生理指標(biāo)在抗病性不同的品種中具有獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制，抗病性強(qiáng)的青稞品種從感病初期，其生理特性指標(biāo)自我調(diào)控力較強(qiáng)，對(duì)條紋病脅迫產(chǎn)生一定的耐受力；抗病性弱的品種的生理特性指標(biāo)自我調(diào)控能力則很弱，對(duì)條紋病脅迫產(chǎn)生較弱的耐受力。本研究結(jié)果為抗病資源的利用和培育抗病新品種奠定了生理基礎(chǔ)。要全面地了解青稞的抗條紋病機(jī)制，還需要從基因水平進(jìn)行進(jìn)一步的探索。