不同炮制方式的續(xù)斷HPLC指紋圖譜及化學(xué)計(jì)量學(xué)研究

潘 俊，李智敏，吳麗華，石 瑤，黃 慧，李晚誼，張 庭，王曉兵，肖 丹*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650223；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665099；4.貢山縣茨開鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 貢山 673500)

【研究意義】中藥材的炮制是為了改變原材料的藥性和降低毒性，提高中藥在臨床治療中的效果和用藥的安全性，炮制技術(shù)在不同程度上對中藥材中有效成分有影響[1]。中藥指紋圖譜是現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制和評價(jià)的基石和核心技術(shù)，因其具有特征性、專屬性、可量化性、穩(wěn)定性、有效性、完整性及細(xì)節(jié)處理的模糊性等特點(diǎn)，可以表達(dá)中藥的整體特性，是一種合理的中藥質(zhì)量控制模式[2]。化學(xué)計(jì)量學(xué)(Chemometrics)是在化學(xué)測量過程中所使用的某種特定數(shù)學(xué)方法或統(tǒng)計(jì)學(xué)方法與數(shù)據(jù)交互關(guān)系的科學(xué)，能對整合后的色譜、光盤數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析[3-5]。中藥指紋圖譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，對中藥材品質(zhì)進(jìn)行更全面、準(zhǔn)確的評價(jià)。續(xù)斷開始記載于《神龍本草經(jīng)》，列為上品，傳統(tǒng)為補(bǔ)陽藥[6]。藥用部位為植物川續(xù)斷(DipsacusasperoidesWall.ex Henry)的干燥根；主治肝腎不足，腰膝酸軟、風(fēng)濕痹痛，跌撲損傷等病癥[7]。續(xù)斷化學(xué)成分主要有三萜皂苷類、生物堿類、揮發(fā)油類、環(huán)烯醚萜類、多糖類以及其它一些成分[8-11]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】續(xù)斷作為云南道地藥材，運(yùn)用指紋圖譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，對其炮制前后的質(zhì)量評價(jià)研究較少。焦?jié)壤肏PLC-ELSD指紋圖譜分析方法對續(xù)斷炮制前后的內(nèi)在成分進(jìn)行研究，結(jié)果顯示續(xù)斷炮制前后化學(xué)成分有差異[12]。羅君等利用HPLC指紋圖譜技術(shù)，對續(xù)斷生品和酒炙品的化學(xué)成分進(jìn)行分析研究，結(jié)果顯示綠原酸及川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量較炮制前有增加[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】依據(jù)液相色譜的指紋特性，利用液相色譜法對11批不同產(chǎn)地的續(xù)斷藥材進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用高效液相色譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對不同炮制方法的續(xù)斷進(jìn)行指紋圖譜研究，旨在為續(xù)斷質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

續(xù)斷樣品來源于不同省份藥材市場采購獲得，經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為川續(xù)斷科川續(xù)斷(DipsacusasperoidesC.Y.Cheng et T.M.Ai)的根莖，詳細(xì)信息見表1。

表1 續(xù)斷樣品Table 1 The sample of Dipsacus asperoides

1.2 試劑

川續(xù)斷皂苷Ⅵ購買于北京中科質(zhì)檢生物有限公司;乙腈(GR，美國 Sigma)；水(自制超純水)；甲醇(AR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。

1.3 儀器

LC20A高效液相色譜儀(日本島津公司)； DGG-9123AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；AX124ZH電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)；BL10-250A超聲波清洗機(jī)(上海比朗儀器有限公司)；UPT-I-20T純水器(成都超純科技有限公司)； HH-4數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?金壇區(qū)西域新儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，DS-5 μm，12 nm)；流動(dòng)相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，5 %B；5～12 min，15 %B；12～27 min，25 %B；27～42 min，30 %B；42～55 min，35 %B；55～60 min，35 %)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；檢測波長：212 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

1.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取續(xù)斷皂苷VI對照品2 mg，加甲醇配制成含續(xù)斷皂苷VI 2 mg·mL-1的溶液，即得。

1.4.3 供試品溶液的制備 續(xù)斷1號(hào)樣品0.5 g，甲醇25 mL，置入具塞錐形瓶，搖勻，稱重，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻，稱重，甲醇補(bǔ)足重量，過濾，取濾液5 mL，甲醇稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜即得。

1.4.4 供試品溶液測定 供試品溶液進(jìn)樣量為20 μl，按“1.4.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(中國藥典委員會(huì)2004A 版)對數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度分析。采用SPASS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類、K-均值方法及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn) 以續(xù)斷樣品S1號(hào)為對象，以“1.4.3”項(xiàng)方法處理樣品， “1.4.1”項(xiàng)色譜條件測定色譜數(shù)據(jù)，重復(fù)進(jìn)樣6次，考察樣品中共有峰的相對保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果顯示考察項(xiàng)前者的RSD為0.76 %，后者的RSD為4.15 %，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 以續(xù)斷樣品S1號(hào)為對象，以“1.4.3”項(xiàng)方法處理樣品，重復(fù)稱取0.5 g樣品6份，依次進(jìn)樣，考察樣品共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果顯示考察項(xiàng)前者的RSD為0.81 %，后者的RSD為3.98 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 以續(xù)斷樣品S1號(hào)為對象，以1.4.3項(xiàng)方法處理樣品，分別在24 h內(nèi)每隔2 h進(jìn)樣分析，考察樣品共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果考察項(xiàng)前者的RSD為0.57 %，后者的RSD為4.03 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 HPLC指紋圖譜建立

取15批續(xù)斷樣品，以1.4.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按1.4.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)條件一致的情況下，以色譜峰保留時(shí)間和紫外掃描圖譜為比較參數(shù)，色譜圖匹配得到23個(gè)共有峰，峰面積和保留時(shí)間見表2，色譜指紋圖見圖1。

表2 15批續(xù)斷樣品的共有峰保留時(shí)間及相對峰面積Table 2 Relative retention time and relative peak area of common peak for 20 batches of Dipsacus asperoides

2.3 共有峰面積及樣品相似度計(jì)算

為避免圖譜直觀分析的主觀性對分析結(jié)果的影響，將15批藥材樣品的HPLC圖譜信號(hào)數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(中國藥典委員會(huì)2004A 版)，圖譜中由于15號(hào)峰分離度良好，峰位居中，峰面積較大，穩(wěn)定性好，所有樣品共有，因此設(shè)定15號(hào)為參比峰，色譜圖進(jìn)行自動(dòng)匹配，中位數(shù)法生成對照圖譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.10 s，計(jì)算15批藥材的相似度。相似度結(jié)果見表3。各樣品色譜疊加圖見圖1。

表3 15批續(xù)斷HPLC指紋圖譜相似度評價(jià)Table 3 Similarity analysis of HPLC fingerprints of fifteen batches of Dipsacus asperoides

以續(xù)斷藥材共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似性評價(jià)，15批續(xù)斷樣品的相似度分析結(jié)果見表3。指紋圖譜分析結(jié)果表明，所測樣品中有11 批續(xù)斷藥材指紋圖譜中位數(shù)相關(guān)系數(shù)在 0.900～0.99，相似度較高，達(dá)到了相似度的基本要求，說明樣品比較好。其中樣品(S1、S2、S3、S6、S7、S9～S12，S15)質(zhì)量差異較小，相似度均大于0.9。編號(hào) S4、S5 、S8 、S13、S14 的藥材指紋圖譜相關(guān)系數(shù)小于0.90 (大于0.850 )，樣品有一定的差別。

2.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.4.1 聚類分析 續(xù)斷樣品的色譜數(shù)據(jù)通過IBM SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，以峰面積作為變量，對11批續(xù)斷藥材進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)分類距離d=5時(shí)，15批次續(xù)斷樣品聚為2類，編號(hào)為S1～S12的樣品聚為第一類，為干燥、發(fā)汗處理的樣品；編號(hào)為S13～S15的樣品聚為第二類，是用酒、鹽炮制的加工品(圖2)。

2.4.2 主成分分析 將15批續(xù)斷樣品的23個(gè)共有峰峰面積用IBM SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的因子分析進(jìn)行主成分分析，以主成分特征值>1和方差貢獻(xiàn)率>85 %作為選擇主成分的依據(jù)。提取到6個(gè)主成分因子，其特征值>13.0，累積方差貢獻(xiàn)率為86.99 %，即包括大部分信息，根據(jù)主成分分析得到所有樣本的PCA二維投影圖見圖3，圖中每一個(gè)點(diǎn)對應(yīng)一個(gè)樣本，共分為2類，與聚類分析結(jié)果一致。

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的確定

通過對流動(dòng)相的篩選比較，采用乙腈-水梯度洗脫能使峰集中在3～55 min內(nèi)得到較多的色譜峰，實(shí)現(xiàn)色譜峰的分離度好、基線漂移小的實(shí)驗(yàn)要求。

3.2 指紋圖譜相似度評價(jià)

通過對15批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)樣品HPLC指紋圖譜有一定差異，但都擁有相同的色譜特征峰，經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》相似度計(jì)算顯示，15個(gè)樣品的相似性一般，編號(hào) S4、S5、S8、S13、S14 的藥材指紋圖譜相關(guān)系數(shù)小于0.90(大于0.850)，與其他批次的續(xù)斷樣品相比，差異性大。說明產(chǎn)地和加工方法對續(xù)斷藥材的質(zhì)量都有影響。

3.3 聚類分析與主成分分析評價(jià)

運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)中的聚類分析和主成分分析方法對15批續(xù)斷樣品的HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，續(xù)斷樣品得到了很好的聚類效果，主成分分析的二維得分圖與聚類分析得到的結(jié)果一致，可以看出，干燥和發(fā)汗方法對續(xù)斷中化學(xué)成分的影響小于酒制、鹽制對續(xù)斷藥材的影響。續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量可以看出酒制和鹽制對續(xù)斷藥材有效成分的含量有較大影響，發(fā)汗對續(xù)斷藥材有效成分的含量影響較小。

4 結(jié) 論

方法學(xué)考察結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)采用的色譜方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，有效分離并獲得較多的特征峰，此方法可行，簡便快捷，為控制和評價(jià)炮制后續(xù)斷藥材的質(zhì)量提供參考。本研究結(jié)論與樊媛潔[14]研究結(jié)果一致，炮制技術(shù)中增加輔料不僅使續(xù)斷中皂苷類成分發(fā)生變化，對其他有效成分也具有一定影響，所含有效成分的種類和含量有差別。