基于HPLC指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)評價(jià)白及飲片質(zhì)量

朱環(huán)，謝秉湘，張崇生，葉鳴，張麗萍

溫州市食品藥品檢驗(yàn)科學(xué)研究院，浙江 溫州 325000

白及為蘭科植物白及[Bletzlla striata （Thunb.）Reichb.f.]的干燥塊莖[1-2]，因其在咯血、外傷出血、嘔血、皮膚皸裂、美白等方面有著良好的功效[3-4]，而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥美容等行業(yè)。中藥臨床療效與藥材質(zhì)量息息相關(guān)[5]，傳統(tǒng)中藥材“看貨評級，分檔議價(jià)”的質(zhì)量評價(jià)機(jī)制[6]只注重性狀，而現(xiàn)行《中國藥典》（2015年版）僅收載了白及性狀、顯微鑒別、薄層色譜鑒別、水分、總灰分和二氧化硫這六項(xiàng)藥材通用的檢驗(yàn)方法，缺乏直觀化、數(shù)據(jù)化的品質(zhì)評價(jià)手段。為了規(guī)范白及市場，很有必要對其質(zhì)量現(xiàn)狀做一個(gè)全面評價(jià)。為了避免樣品的地域局限性，本研究共收集了包括浙江、安徽、河北、湖南、江西在內(nèi)的30家飲片生產(chǎn)企業(yè)的36批次樣品，通過樣品的大量收集，借助高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，結(jié)合相似度、聚類分析和多元統(tǒng)計(jì)分析，為全面評價(jià)市售白及質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料 Agilent 1260系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），XSE205DU十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多集團(tuán)），DHG-9091A電熱恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），SX2-4-10NP箱式電阻爐（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），STEHDB-107-1二氧化硫殘留量測定儀（濟(jì)南盛泰電子科技有限公司），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司），KQ-300TDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸為分析純，水為純水。白及經(jīng)鑒定均為蘭科植物白及的干燥塊莖。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)檢查項(xiàng)目的測定：按照《中國藥典》（2015年版）一部“白及”項(xiàng)下方法對36批次樣品的水分、總灰分、二氧化硫殘留量進(jìn)行檢測。

1.2.2 指紋圖譜色譜條件：在參考文獻(xiàn)[7-9]和本實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)上[10]，建立白及指紋圖譜，選用Thermo Hypersil Gold Aq色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為280 nm，進(jìn)樣量20 μL，以乙腈為流動(dòng)相A，0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，按表1梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 指紋圖譜樣品溶液的制備：精密稱取白及中粉1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水50 mL，密塞，稱定重量，超聲（功率300 W，頻率 40 kHz）處理60 min，放冷，再稱量，用70%甲醇水補(bǔ)足減失的量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.4 聚類分析與多元統(tǒng)計(jì)分析：將色譜圖信息導(dǎo)入ChemPattern軟件建立相似度模型并確定共有峰，再將共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后分別導(dǎo)入SPSS21.0 和Simca-P 13.0軟件，對樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類并建立偏最小二乘判別分析（p artial least squares discriminant analysis，PLS-DA）模型，其中PLSDA是有監(jiān)督模式的識別方法，先將樣品按不同的類別屬性分組，繼而建立模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其著重強(qiáng)調(diào)組間差異性，削弱組內(nèi)與研究無關(guān)的隨機(jī)差異，從而更好地把握指紋圖譜多維數(shù)據(jù)整體特征和變異規(guī)律，并能有效解決樣本量少、自變量較多、相關(guān)性較高的數(shù)學(xué)模型，該方法能夠找出兩組白及之間存在顯著性差異的化學(xué)成分。

2 結(jié)果

2.1 水分、總灰分和二氧化硫殘留量測定 36批次樣品水分介于8.6%～14.0%（規(guī)定≤15.0%），總灰分介于1.4%～4.3%（規(guī)定≤5.0%），二氧化硫殘留量介于1～384 mg/kg（規(guī)定≤400 mg/kg），二氧化硫殘留量低于50 mg/kg占比為77.8%，表明白及無硫化趨勢明顯，結(jié)果均符合規(guī)定（見表2）。

2.2 指紋圖譜精密度試驗(yàn) 取同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，采用國家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件處理，其相似度均大于0.95，且以3號峰（四裂紅門蘭素，即militarine）的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果顯示6個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于3.0%，結(jié)果表明方法精密度良好。

2.3 指紋圖譜重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6份制備樣品溶液，采用國家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件處理，其相似度均大于0.95，且以3號峰（militarine）的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果顯示6個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，采用國家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件處理，其相似度均大于0.95，且以3號峰（militarine）的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果顯示6個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，結(jié)果表明方法所提取的樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 36批次樣品常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果

2.5 指紋圖譜的建立及共有峰的確定 將36批樣品的色譜信息導(dǎo)入ChemPattern 2.1軟件（36批樣品疊加圖，見圖1），所有樣品相似度均大于70%（見圖2），表明該方法建立的白及指紋圖譜穩(wěn)定可靠。再以峰面積為來源，平均數(shù)為統(tǒng)計(jì)方式，篩選占比5%以上的共有峰，采用高斯曲線模擬方法，結(jié)果顯示36批樣品存在6個(gè)共有峰（見圖3）。

2.6 聚類分析與多元統(tǒng)計(jì)分析 以各共有峰面積除以6個(gè)共有峰峰面積之和的數(shù)值作為原始數(shù)據(jù)，以組間連接法結(jié)合余弦距離對36批次樣品進(jìn)行聚類分析（見圖4）。結(jié)果顯示，36批樣品可聚為兩類，S4，S5，S7，S9，S16～S18，S25，S28，S29，S31～S33，S35～S36聚為一類，S1～S3，S6，S8，S10～S15，S19～S24，S26，S27，S30，S34聚為一類。

圖1 白及樣品HPLC色譜圖

圖2 白及樣品相似度評價(jià)

圖3 白及樣品共有色譜峰圖

為更好地觀察上述聚類分析結(jié)果，同時(shí)也為找出差異性的化學(xué)成分，將各共有峰峰面積除以6個(gè)共有峰峰面積之和的數(shù)值作為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。以白及樣品共有峰比值數(shù)據(jù)設(shè)定分類變量為Y，樣品編號按聚類分析結(jié)果分為兩組：S4，S5，S7，S9，S16～S18，S25，S28，S29，S31～S33，S35～S36為第一組，S1～S3，S6，S8，S10～S15，S19～S24，S26，S27，S30，S34為第二組，進(jìn)行PLSDA分析。結(jié)果顯示，由聚類分析為兩大類的白及樣品能夠明顯區(qū)分開[R2X（cum）=0.63，R2Y（cum）= 0.71，Q2=0.59，均大于0.5，見圖5A]，表明所建模型穩(wěn)定且預(yù)測能力較強(qiáng)。從相對應(yīng)的載荷圖（見圖5B）可知，3、4、5號色譜峰距原點(diǎn)較遠(yuǎn)，權(quán)重值較大，因此，它們所對應(yīng)的化學(xué)成分對兩組的區(qū)分貢獻(xiàn)較大。由圖5C可知變量5（色譜峰）自變量投影重要性指標(biāo)（variable imp ortance in p rojection，VIP）值大于1，這表明該色譜峰所代表的化學(xué)成分對兩組的區(qū)分貢獻(xiàn)較大，為差異標(biāo)志物。

圖4 36批白及樣品的聚類分析結(jié)果

圖5 36批白及樣品的多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

3 討論

目前，針對白及質(zhì)量評價(jià)以含量測定[11-14]為主。然而，中藥材成分復(fù)雜，而且白及作為一種廣域生長的作物遍布全國，僅以個(gè)別含量的高低難以對其作出全面評價(jià)。指紋圖譜能夠從整體上表現(xiàn)出中藥的內(nèi)在質(zhì)量狀況[15-17]，借助多元統(tǒng)計(jì)分析更能直觀、全面地評價(jià)其內(nèi)在品質(zhì)[18-19]。如今，此類結(jié)合式的綜合評價(jià)方法得到了學(xué)術(shù)界認(rèn)可，如徐鋒等[20]通過聚類分析和主成分分析評價(jià)地瓜藤的質(zhì)量，林秀敏等[21]建立指紋圖譜并借助化學(xué)計(jì)量法對白芍進(jìn)行綜合分析，曹斯瓊等[22]基于主成分分析及聚類分析評價(jià)王不留行質(zhì)量，張曉男等[23]通過多元統(tǒng)計(jì)分析評價(jià)炮制前后桃仁的質(zhì)量等。因此，為了更有效地控制白及的質(zhì)量，保證各市售樣品質(zhì)量的穩(wěn)定性，本項(xiàng)目通過指紋圖譜，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，比較了36批次樣品的質(zhì)量現(xiàn)狀，篩選出造成白及質(zhì)量差異的主要化學(xué)成分，為規(guī)范白及的種植與炮制工藝提供參考依據(jù)。

此次監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各廠家的白及樣品按 《中國藥典》（2015年版）檢驗(yàn)全部合格，并且無硫化趨勢明顯，表明飲片企業(yè)對藥材質(zhì)量的良好把控和藥材市場的日益規(guī)范。為了更深一步了解白及的內(nèi)在質(zhì)量狀況，我們通過指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對其進(jìn)行綜合評價(jià)，發(fā)現(xiàn)36批白及樣品的相似度均大于70%，存在6個(gè)共有峰，聚類分析和PLS-DA結(jié)果一致，顯示樣品能夠分成兩大類，提示市場上白及存在質(zhì)量和臨床效果不一致的可能性，這可能與不同生長環(huán)境以及不同栽培方式化學(xué)成分積累的差異有關(guān)。這些結(jié)果可為白及的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。