基于生物信息學(xué)篩選子宮內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)的lncRNAs分子標(biāo)簽

胡云雙，張穎，曾海平

溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325000

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的癌癥之一，目前位列發(fā)達(dá)國(guó)家女性惡性腫瘤中的第四位，我國(guó)每年也約有2萬(wàn)人死于該病[1-2]。雖然子宮內(nèi)膜癌的手術(shù)、化療及免疫治療都取得了一定的進(jìn)展[3]，但患者的病死率仍居高不下[4]。因此，從分 子層面更深入地探索其發(fā)病機(jī)制[5]，研究影響子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的分子標(biāo)簽來(lái)評(píng)估與預(yù)測(cè)患者生存率，具有臨床實(shí)際意義[6]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA） 是一類長(zhǎng)度在200～100 000 nt之間非蛋白編碼RNA分子，常被用于腫瘤診斷或預(yù)后評(píng)估，是一類極具潛力的新一代標(biāo)志物[7]。研究表明，lnc RNA作為重要的調(diào)控因子，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn) 移[8]，但目前關(guān)于lncRNAs在子宮內(nèi)膜癌中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制仍鮮見(jiàn)報(bào)道[9]。本研究提取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中子宮內(nèi)膜癌的lnc RNA表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，通過(guò)差異表達(dá)分析和單因素LASSO Cox回歸，尋找與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)的IncRNA，采用多因素Cox回歸模型構(gòu)建預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA分子標(biāo)簽，為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后評(píng)估提供進(jìn)一步支持。

1 資料和方法

1.1 子宮內(nèi)膜癌lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料的收集與處理 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://p ortal.gdc.cancer.gov/）中下載子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織的RNAseq level 3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床相關(guān)資料，數(shù)據(jù)集截止日期為2020年2月。樣本篩選納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①經(jīng)過(guò)病理證實(shí)為原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌，并且術(shù)前未經(jīng)任何放化療；②預(yù)后信息完整無(wú)缺失，預(yù)后隨訪時(shí)間大于30 d。除去臨床信息缺失的個(gè)體，共計(jì)523個(gè)子宮內(nèi)膜癌和23個(gè)癌旁組織納入分析。

1.2 lncRNA差異表達(dá)分析 采用R語(yǔ)言的“edgeR”包[10]對(duì)子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織的lncRNA進(jìn)行表達(dá)差異篩選分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：log2|差異倍數(shù)（FC）| ≥1且假陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05。用R語(yǔ)言“ggplot2”包繪制火山圖，采用R語(yǔ)言“ComplexHeatmap”包繪制熱圖，顯示其在癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)情況。

1.3 LASSO Cox預(yù)后模型構(gòu)建與驗(yàn)證 本研究采用隨機(jī)數(shù)生成法將523例子宮內(nèi)膜癌患者分為訓(xùn)練集（training set，n=262）和測(cè)試集（testing set，n=261）兩個(gè)隊(duì)列。樣本基本特征：訓(xùn)練集中位年齡為63（31～90）歲，中位身高為161（142～183）cm，腫瘤分期I期160例，II期26例，III期62例，IV期14例；測(cè)試集中位年齡為64（34～90）歲，中位身高為161.5（130～178）cm，腫瘤分期I期167例，II期27例，III期54例，IV期13例。訓(xùn)練集用于學(xué)習(xí)特征的選擇和模型的估計(jì)，測(cè)試集作為內(nèi)部驗(yàn)證隊(duì)列來(lái)評(píng)估模型的預(yù)測(cè)性能。

使用R語(yǔ)言的“Survival”包進(jìn)行單因素Cox回歸分析，獲得與預(yù)后相關(guān)的lnc RNA分子。對(duì)與預(yù)后顯著相關(guān)的lncRNA分子（P＜0.001）進(jìn)行LASSO Cox回歸分析篩選變量，構(gòu)建lncRNAs分子標(biāo)簽[11]。lncRNAs分子標(biāo)簽=Σ（回歸系數(shù)×基因表達(dá)量），以風(fēng)險(xiǎn)值的中位數(shù)為閾值，把子宮內(nèi)膜癌患者分成高、低兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組別。繪制Kaplan-Meier生存曲線，采用Log-rank法檢驗(yàn)比較兩組患者的總生存率差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，為評(píng)估lncRNAs分子標(biāo)簽?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)性能，我們?cè)跍y(cè)試集中進(jìn)行驗(yàn)證，考察相關(guān)的lnc RNAs用于預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的可能性。

1.4 預(yù)后模型ROC曲線評(píng)價(jià) 采用R包“Survival”和“timeROC”繪制1、3、5年總生存率的ROC曲線，計(jì)算曲線下的面積（area under the curve，AUC），評(píng)估預(yù)后模型在不同時(shí)間終點(diǎn)的預(yù)測(cè)性能。

1.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 從MsigDBv6.2數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）中下載“C2：經(jīng)典通路”基因集，采用默認(rèn)基因富集統(tǒng)計(jì)分析方法[12]，進(jìn)行GSEA，執(zhí)行1 000次置換檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為是顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 與預(yù)后相關(guān)的子宮內(nèi)膜癌差異lncRNA的篩選 基于FDR＜0.05且|log2FC|＞2的篩選標(biāo)準(zhǔn)共得到2 277個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs（見(jiàn)圖1A），包括1 303個(gè)表達(dá)上調(diào)的lnc RNAs和974個(gè)表達(dá)下調(diào)的 lncRNAs（見(jiàn)圖1B）。

圖1 子宮內(nèi)膜癌差異lncRNAs的篩選

2.2 子宮內(nèi)膜癌預(yù)后模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià) 單因素Cox回歸初步篩選出18個(gè)和子宮內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)的差異lncRNAs（P＜0.001）（見(jiàn)表1），通過(guò)LASSO回歸分析（見(jiàn)圖2A、2B）降維確定了13個(gè)關(guān)鍵的lncRNAs分子。采用多因素Cox回歸模型進(jìn)行l(wèi)ncRNAs的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，Risk Score=（0.13118×AC005381.1）+（0.09103×AC009237.15）+（0.25714×AC011294.1）+ （0.21220×AC017074.1）+（0.11446×AC073842.2）+ （0.04660×AC108025.2）+（0.28335×AL121906.2）（-0.12554×AP000808.1）+（-0.19050×LINC00475）+ （0.14988×LINC01116）+（0.17987×LINC01250）+（0.21181×NCAM1-AS1）+（-0.30462×UNQ6494），以風(fēng)險(xiǎn)得分的中位值（0.92）為閾值，將訓(xùn)練集中的262例患者分為高風(fēng)險(xiǎn)（＞0.92，n=131）組和低風(fēng)險(xiǎn)（≤0.92，n=131）組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組患者平均生存時(shí)間較短，具有較多的死亡人數(shù)，其對(duì)應(yīng)熱圖也顯示出這13個(gè)lncRNAs分子的表達(dá)量在2個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組別中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖3A）。Kaplan-Meier生存曲線（見(jiàn)圖3B）顯示低風(fēng)險(xiǎn)組患者中位生存時(shí)間（3.03年）長(zhǎng)于高風(fēng)險(xiǎn)組（2.59年），總生存率也高于高風(fēng)險(xiǎn)組（P＜0.001）。ROC進(jìn)行預(yù)測(cè)性能評(píng)估，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌患者1、3、5年總生存率AUC分別為0.771、0.868、0.864（見(jiàn)圖3C）。

表1 單因素Cox回歸分析初步篩選和子宮內(nèi)膜癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA

圖2 LASSO回歸分析

為評(píng)估預(yù)后模型的預(yù)測(cè)能力，以測(cè)試集中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值（0.98）為閾值，將測(cè)試集的患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。如圖4A所示，與訓(xùn)練集一致，測(cè)試集中高風(fēng)險(xiǎn)組患者（130例）與低風(fēng)險(xiǎn)組患者（131例）相比生存時(shí)間更短，死亡人數(shù)更多，熱圖也顯示這13個(gè)lncRNAs的表達(dá)量在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kaplan-Meier生存曲線（見(jiàn)圖4B）表明，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的總生存率較低（P＜0.001）。ROC分析顯示，測(cè)試集中子宮內(nèi)膜癌患者1、3、5年總生存率AUC分別為0.751、0.757、0.730（見(jiàn)圖4C）。

圖3 訓(xùn)練集lncRNAs熱圖、Kaplan-Meier圖和ROC曲線圖

2.3 篩選的lncRNAs分子標(biāo)簽?zāi)Ｐ团c臨特征指標(biāo)的聯(lián)合分析 本研究收集了子宮內(nèi)膜癌患者的臨床信息，在訓(xùn)練集中進(jìn)行單因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤臨床分期（HR=1.98，P＜0.001）、腫瘤組織學(xué)分級(jí)（HR=2.89，P＜0.001）與預(yù)后相關(guān)。構(gòu)建臨床指標(biāo)多因素Cox回歸預(yù)測(cè)模型Risk Score=（0.5231×腫瘤臨床分期）+（0.7608×腫瘤組織學(xué)分級(jí)），采用ROC預(yù)測(cè)模型效能，如圖5A所示，在訓(xùn)練集中，患者1、3、5年總生存率AUC分別為0.678、0.767、0.801。進(jìn)一步構(gòu)建lnc RNAs分子標(biāo)簽聯(lián)合臨床指標(biāo)Cox回歸模型，ROC分析顯示，患者1、3、5年總生存率AUC分別為0.755、0.874、0.877（見(jiàn)圖5B）。在測(cè)試集中，ROC分析臨床指標(biāo)和lncRNAs分子標(biāo)簽聯(lián)合臨床指標(biāo)Cox回歸模型的預(yù)測(cè)效能，患者1、3、5年總生存 率AUC分別為0.828、0.720、0.719和0.802、0.767、0.772（見(jiàn)圖5C-D）。綜合來(lái)看，無(wú)論在訓(xùn)練集還是測(cè)試集中，lnc RNAs分子標(biāo)簽聯(lián)合臨床指標(biāo)模型預(yù)測(cè)效能最好。

2.4 子宮內(nèi)膜癌的GSEA GSEA結(jié)果表明（見(jiàn)圖6），多條致癌通路在高風(fēng)險(xiǎn)組中富集，包括小分子泛素樣調(diào)節(jié)蛋白化通路（SUMO pathway）、PTK6調(diào)控的細(xì)胞周期（PTK6 regulates cell cycle）、微小染色體維持蛋白通路（MCM pathway），表明它們參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。相反，免疫相關(guān)和代謝通路在低風(fēng)險(xiǎn)組富集，如苯丙氨酸和酪氨酸代謝（p henylalanine and tyrosine metabolism）、TCRA通路（TCRA p athway）、阿爾法亞麻酸代謝 （Alpha linolenic acid metabolism）等。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中一種最常見(jiàn)的類型[13]，隨著對(duì)它的認(rèn)識(shí)不斷深入，子宮內(nèi)膜癌的診療和預(yù)后評(píng)估也取得了一定成效，但目前尚缺乏突破性進(jìn)展，子宮內(nèi)膜癌的個(gè)體化治療仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。

圖4 測(cè)試集lncRNAs熱圖、Kaplan-Meier圖和ROC曲線圖

圖5 ROC曲線對(duì)臨床指標(biāo)預(yù)測(cè)模型及l(fā)ncRNAs分子標(biāo)簽聯(lián)合臨床指標(biāo)模型的預(yù)測(cè)性能評(píng)價(jià)

本研究采用的LASSO Cox回歸算法與傳統(tǒng)的Cox回歸相比較，可以很好地解決高維特征數(shù)據(jù)的預(yù)后分析，有效避免多個(gè)變量間的共線性問(wèn)題。此外，本研究構(gòu)建的lncRNA分子標(biāo)簽的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型綜合了13個(gè)lncRNA的表達(dá)信息，顯著提高子宮內(nèi)膜癌預(yù)后評(píng)估能力。相關(guān)研究也表明，lncRNA分子標(biāo)簽?zāi)Ｐ团c單個(gè)lncRNA相比可以更好地評(píng)估腫瘤的預(yù)后，更具有臨床價(jià)值[14]。時(shí)間依賴的ROC曲線分析對(duì)1、3、5年的生存時(shí)間的預(yù)測(cè)也體現(xiàn)了該模型較強(qiáng)的魯棒性。而且預(yù)測(cè)的13個(gè)lncRNA中有部分已被報(bào)道與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，比如LINC01116分子與腫瘤的增殖以及凋亡相關(guān)，LINC01116可以靶向miR-520a-3p，影響IL6R通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[15]。LINC01116還通過(guò)調(diào)節(jié)IFI44促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥[16]。在缺氧條件下，LINC00475沉默可以下調(diào)AGAP2，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤產(chǎn)生抑制作用[17]。另外，本研究進(jìn)一步構(gòu)建了lncRNAs分子標(biāo)簽聯(lián)合臨床指標(biāo)模型，ROC曲線發(fā)現(xiàn)lncRNAs分子標(biāo)簽聯(lián)合臨床指標(biāo)模型可進(jìn)一步提高預(yù)測(cè)效能。GSEA通路富集分析進(jìn)一步揭示了細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因集在高風(fēng)險(xiǎn)組中有顯著富集，而免疫和代謝相關(guān)通路更多地在低風(fēng)險(xiǎn)組中富集，暗示不同通路的激活可以影響子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后。

但本研究也存在著一些局限：①未對(duì)本研究中13個(gè)lncRNA進(jìn)行相關(guān)的腫瘤機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究，探索lncRNA是如何影響子宮內(nèi)膜癌的增殖和凋亡，以及如何影響預(yù)后；②該數(shù)據(jù)集源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，沒(méi)有漢族人特有的子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)，因此，未能驗(yàn)證構(gòu)建的Inc RNA標(biāo)簽?zāi)芊耦A(yù)測(cè)漢族人子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后。這些問(wèn)題需要在以后的研究中進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，篩選并構(gòu)建了子宮內(nèi)膜癌預(yù)后13個(gè)差異lncRNA的分子標(biāo)簽?zāi)Ｐ?，可以把子宮內(nèi)膜癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，并為該疾病的預(yù)后預(yù)測(cè)以及患者的個(gè)性化治療方案提供指導(dǎo)依據(jù)，同時(shí)本研究策略也可以對(duì)其他腫瘤預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物的篩選提供有效參考。

圖6 子宮內(nèi)膜癌的GSEA