楊桃根中2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-環(huán)己二酮對(duì)糖尿病小鼠心肌損傷的影響*

吳婭妮，韋曉潔，高雨桐，陳 銘，韋秀莎，黃仁彬△，張士軍△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530299）

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病[1]，長期的高血糖會(huì)導(dǎo)致多種糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生，包括腎病、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、中風(fēng)、心血管疾病和周圍血管疾病等[2]。糖尿病心肌病是糖尿病心血管并發(fā)癥最常見的疾病之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，由多因素造成[3]，氧化應(yīng)激反應(yīng)參與調(diào)節(jié)并啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[4]。李偉斯等[5]已報(bào)道楊桃根總提取物能夠在降低糖尿病大鼠血糖的同時(shí)降低血清中心肌酶活性，對(duì)糖尿病大鼠心肌損害有一定的預(yù)防治療作用。而2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-環(huán)己二酮（2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione，DMDD）是從楊桃根提取分離所得的黃酮類單體化合物，楊桃根DMDD 具有良好的降血糖效果，能夠抑制糖尿病腎病及阿爾茨海默模型小鼠的氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡[6-7]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制糖尿病小鼠心肌損傷模型，探討楊桃根DMDD對(duì)糖尿病小鼠心肌損傷的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠共50只，6～8周齡，體重（18±2）g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：XYKG桂2014-0003。

1.2 主要藥物與試劑 中藥材楊桃根采自廣西靈山縣，依據(jù)課題組前期制備方法[5]自行制備楊桃根DMDD。鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司）；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）試劑盒均購自上海執(zhí)誠生物科技有限公司；肌酸激酶同工酶（CK-MB）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）購自南京建成生物研究所；天狼星紅染色液購自安徽雷根生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AxyPrep總RNA小量制備試劑盒購自美國Axygen 公司；PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 模型制備及分組給藥 50 只雄性C57BL/6 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只小鼠作為空白組，剩余小鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，之后給予鏈脲佐菌素（STZ）100 mg/kg空腹腹腔注射，72 h后測(cè)空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol/L 視為造模成功。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組，DMDD 高（50 mg/kg）、中（25 mg/kg）、低（12.5 mg/kg）劑量組，每組10 只，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)，灌胃給藥治療8周，1次/d，空白組灌胃等劑量蒸餾水。

1.4 血清指標(biāo)檢測(cè) 給藥結(jié)束后，各組小鼠禁食不禁水12 h，摘除眼球收集血液，頸椎脫臼處死小鼠。血液室溫放置30 min，4 ℃下3 500 r/min 離心15 min，收集血清。全自動(dòng)血生化分析儀檢測(cè)血清中CK、LDH 含量。使用ELISA 法檢測(cè)CK-MB 水平，嚴(yán)格按照說明書操作步驟進(jìn)行。

1.5 心肌組織MDA、SOD、GSH 含量檢測(cè) 處死小鼠后，迅速取出心臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水清洗殘留血液。取適量心肌組織，按照1∶9 的比例加入生理鹽水制備成10%心肌組織勻漿，4 ℃下3 500 r/min 離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測(cè)MDA、SOD、GSH 含量，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。

1.6 心肌組織蘇木精－伊紅（HE）、天狼星紅染色和TUNEL 染色 取小鼠心臟1/3 的心尖處，放入4%多聚甲醛，固定24 h，常規(guī)脫水，進(jìn)行石蠟包埋，切片，行HE 染色，顯微鏡下觀察心肌結(jié)構(gòu)病理變化。切片常規(guī)脫蠟至水，行天狼星紅染色，滴染1 h，流水沖洗，蘇木精染細(xì)胞核，常規(guī)脫水、中性樹脂固封，于光學(xué)顯微鏡下觀察膠原纖維增生情況。切片參照TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，于光鏡下觀察，細(xì)胞核染成棕黃色的為凋亡細(xì)胞。采用Image J圖像分析軟件計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達(dá) 提取心臟組織總RNA，測(cè)定總RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ABI 7300 系統(tǒng)完成PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：50 ℃2 min，95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：Bax上游：5’-TTGCCCTCTTCTACTTTGCTAG-3’，下游：5’-CCATGATGGTTCTGATCAGCTC-3’；Bcl-2 上游：5’-GATGACTTCTCTCGTCGCTAC-3’，下游：5’-GAACTCAAAGAAGGCCACAATC-3’；Caspase-3 上游：5’-AGTGGGACTGAG GAGAT-3’，下游：5’-GTAACCAGGTGCTGTGAGGTAAG-3’；β-actin 上游：5’-GTCGAGTCGCGTCCACC-3’，下游：5’-GTCATCCATGGCGAACTGGT-3’。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMDD 對(duì)小鼠血清中空腹血糖（FBG）、CK、CK-MB、LDH 水平的影響 與空白組相比，模型組小鼠血清中的FBG、CK、CK-MB、LDH 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，DMDD 各劑量組FBG、CK、CK-MB、LDH 水平明顯下降（P＜0.05 或P＜0.01），且DMDD 高、中劑量組FBG 低于DMDD低劑量組（P＜0.05），DMDD 高劑量組心肌酶低于DMDD低劑量組（P＞0.05），見表1。

表1 DMDD對(duì)小鼠FBG、CK、CK-MB、LDH的影響，n=10

表1 DMDD對(duì)小鼠FBG、CK、CK-MB、LDH的影響，n=10

與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DMDD中劑量組比較，$P＜0.05；與DMDD低劑量組比較，&P＜0.05。

2.2 DMDD 對(duì)小鼠心肌組織MDA、SOD、GSH 含量的影響 與空白組相比，模型組小鼠血清中的MDA水平顯著升高（P＜0.01），SOD、GSH水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組小鼠相比，DMDD 能夠顯著提高小鼠SOD、GSH 含量，降低MDA 含量（P＜0.05 或P＜0.01），且DMDD 高劑量組與DMDD 低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 DMDD對(duì)小鼠心肌結(jié)構(gòu)、纖維增生和心肌凋亡的影響 HE 染色可見空白組小鼠心肌排列緊密整齊，結(jié)構(gòu)較為完整；模型組小鼠心肌排列不規(guī)則，心肌間質(zhì)變寬，可見部分心肌纖維斷裂；DMDD 各劑量組小鼠心肌組織細(xì)胞排列稍亂，心肌斷裂減少。天狼星紅染色可見模型組心肌組織含有明顯紅色的膠原纖維，分布雜亂，空白組及DMDD 各劑量組紅色膠原纖維減少。TUNEL染色結(jié)果可見，與空白組相比較，模型組心肌組織有較多棕黃色凋亡細(xì)胞核，凋亡率顯著上升（P＜0.01）；與模型組相比，DMDD各劑量組凋亡細(xì)胞均明顯減少，凋亡率明顯下降（P＜0.01），且DMDD 高劑量組凋亡率低于DMDD低劑量組（P＜0.05），見圖1、圖2。

表2 DMDD對(duì)小鼠MDA、SOD、GSH的影響，n=10

表2 DMDD對(duì)小鼠MDA、SOD、GSH的影響，n=10

與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DMDD中劑量組比較，$P＜0.05；與DMDD低劑量組比較，&P＜0.05。

圖1 心肌組織HE、天狼星紅染色及TUNEL染色圖（×400）

圖2 5組心肌細(xì)胞凋亡率比較

2.4 DMDD 對(duì)小鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組小鼠心肌組織中Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著性升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，DMDD 治療組Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），DMDD 高、中劑量組Caspase-3 mRNA表達(dá)低于DMDD低劑量組（P＜0.05），見表3。

表3 DMDD對(duì)小鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響，n=10

表3 DMDD對(duì)小鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響，n=10

與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DMDD中劑量組比較，$P＜0.05；與DMDD低劑量組比較，&P＜0.05。

3 討論

糖尿病發(fā)病率和死亡率逐年上升，給個(gè)人和社會(huì)造成了巨大壓力。糖尿病心肌病作為糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，與糖尿病患者心力衰竭的高死亡率密切相關(guān)[8]。目前臨床上尚缺乏對(duì)糖尿病心肌病特異性、針對(duì)性的治療藥物。本研究利用高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射小劑量STZ 復(fù)制糖尿病心肌損傷模型，使糖尿病小鼠在持續(xù)的高糖環(huán)境下，心肌組織受到損傷，導(dǎo)致血清中的CK、LDH 及CKMB水平升高（P＜0.01）。CK、LDH及CK-MB均分布于心肌細(xì)胞中，是心肌疾病的常見診斷指標(biāo)，特別是CK-MB，對(duì)心肌損傷有很高的特異性。當(dāng)心肌組織受損，細(xì)胞通透性增加，血清中CK、LDH、CKMB水平隨之升高[9]。而DMDD能夠降低糖尿病小鼠血清中CK、LDH 及CK-MB 水平（P＜0.05），且在病理染色中可見DMDD 減少心肌斷裂及心肌膠原纖維生成，在一定程度上保護(hù)糖尿病心肌損傷。

糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及的發(fā)病因素較多，線粒體產(chǎn)生的活性氧誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷心肌組織是其中重要的發(fā)病機(jī)制[4]。MDA 作為脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物之一，其水平的高低能夠反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度[10]。SOD 在氧化應(yīng)激中具有清除超氧陰離子的專有作用，其活力的高低反映了細(xì)胞清除自由基能力的大小。大多數(shù)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基由GSH 消耗，如果GSH 消耗過多或者產(chǎn)生不足就會(huì)導(dǎo)致組織的脂質(zhì)過氧化損傷[11]。檢測(cè)心肌組織內(nèi)的MDA、SOD和GSH含量，能夠間接表明心肌組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平。本研究中模型組小鼠心肌組織中的MDA 含量顯著性升高，SOD 和GSH 含量顯著性下降（P＜0.01），說明糖尿病小鼠心肌組織抗氧化能力下降。經(jīng)過DMDD 治療后，MDA 含量降低，SOD和GSH活性增強(qiáng)，表明DMDD能夠提高心肌組織的抗氧化能力，通過抑制氧化應(yīng)激改善糖尿病心肌損傷。

心肌組織自由基增多，脂質(zhì)過氧化物累積，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，而心肌細(xì)胞凋亡是心功能障礙發(fā)生的主要原因[12]。Caspase-3是Caspase家族中凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的促凋亡基因Bax 激活下游基因使其活化[13]。Bcl-2作為細(xì)胞凋亡抑制基因，通過抑制線粒體細(xì)胞色素C 的釋放，抑制細(xì)胞凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)利用TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡，qPCR檢測(cè)心肌組織中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)量，結(jié)果表明，模型組小鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，Caspase-3、Bax mRNA 表達(dá)量顯著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）。而DMDD 能夠減少心肌細(xì)胞凋亡，降低Caspase-3、Bax mRNA 表達(dá)，升高Bcl-2 mRNA 表達(dá)，提示DMDD可下調(diào)促凋亡基因表達(dá)，上調(diào)凋亡抑制基因表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上，楊桃根DMDD能夠減輕糖尿病小鼠的心肌損傷，其作用機(jī)制與DMDD 抑制氧化應(yīng)激，減少心肌纖維增生，抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。