-20℃保存1年后對(duì)乙型肝炎病毒DNA定量檢測的影響

韋藍(lán)珍

摘要：目的 探討在-20±5℃的條件下保存，保存時(shí)間1年之后是否對(duì)乙肝病毒 DNA熒光定量檢測的影響。方法 1份結(jié)果為n×103的標(biāo)本分裝成若干份，分成A組和B組，先檢測A組，隨機(jī)的與日常標(biāo)本檢測，B組是1年后再隨機(jī)與日常的標(biāo)本進(jìn)行檢測，查看HBV DNA定量檢測結(jié)果的變化。結(jié)論 據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，在-20±5℃的條件下保存標(biāo)本1年后，再進(jìn)行乙肝病毒 DNA定量檢測，將檢測結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果有顯著的差異，P<0.001。所以想要保存時(shí)間更長的標(biāo)本來做相關(guān)的研究，需要選擇更合適的條件和方式來保存標(biāo)本，才能讓標(biāo)本的檢測結(jié)果更加穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：-20±5℃;乙肝病毒 DNA;1年;定量

【中圖分類號(hào)】R512.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2021）04-328-01

肝炎仍是我國目前常見的傳染病，最常見的是乙型性肝炎，乙型肝炎病毒感染是主要的原因，主要的傳播途徑是經(jīng)血液傳播。被乙型肝炎病毒感染后，更容易引起肝功能的異常，從而導(dǎo)致肝硬化、肝癌等疾病，危害性較大。目前臨床上常用的方法有膠體金法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法、PCR法等，來檢測是否被乙型肝炎病毒感染及治療的效果，由于PCR法的靈敏性和特異性較高，所以本方法在臨床上比較受歡迎 。根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況的不同，有些實(shí)驗(yàn)室是常溫下保存，有些是4℃的條件下保存，保存時(shí)間也不一致，有報(bào)道血清標(biāo)本室溫下保存短期保存3d、4℃保存7d對(duì)PCR檢測HBV DNA含量無顯著的差異[4]，-20℃條件下保存3個(gè)月對(duì)HBV DNA熒光定量檢測結(jié)果無顯著影響[1]。但是遇到特殊情況或者科研的需要，往往需要把標(biāo)本保存更長的時(shí)間再進(jìn)行檢測，如果保存時(shí)間長達(dá)1年是否對(duì)HBV DNA的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.實(shí)驗(yàn)方法

1.1標(biāo)本的處理和保存 取一份檢測結(jié)果為n×103的標(biāo)本，凍融至室溫之后，用EP分裝，分裝之后保存于-20±5℃的冰箱內(nèi)，每次的取出一支與日常的標(biāo)本同時(shí)做實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用的試劑是圣湘生物科技股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸測定試劑盒，實(shí)驗(yàn)方法是實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，實(shí)驗(yàn)的操作步驟嚴(yán)格按照試劑的說明書進(jìn)行。

1.2實(shí)驗(yàn)的步驟

1.2.1試劑的準(zhǔn)備 （在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）

1.2.1.1取出包裝盒中的各組分和同一批號(hào)的核酸釋放劑，室溫放置，將其溫度平衡至室溫后，混勻后備用

1.2.1.2根據(jù)待測標(biāo)本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照以及定量參考品的數(shù)量，按比例（反應(yīng)液38ul/人份+酶混合液2ull/人份+內(nèi)標(biāo)0.2ull/人份）取相應(yīng)量的反應(yīng)液、酶混合液及內(nèi)標(biāo)，充分混勻配成PCR混合液，瞬時(shí)離心備用

1.2.2 標(biāo)本處理及加樣（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）

1.3從-20±5℃的冰箱中取一支已分裝好的標(biāo)本，室溫放置，將其溫度平衡至室溫

1.4取相應(yīng)數(shù)量的PCR反應(yīng)管，每管加5ul的核酸釋放劑后加5ul的標(biāo)本，靜置10min，加配好的PCR混合液40ul，蓋上管蓋，2000rPm離心30秒。

1.4.1 PCR擴(kuò)增（在擴(kuò)增與分析區(qū)進(jìn)行）

1.4.1.1將PCR反應(yīng)管加入擴(kuò)增儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)的設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、定量參考品及待測標(biāo)本，并設(shè)置樣本名稱和定量參考品的濃度

1.4.1.2選擇對(duì)應(yīng)的循環(huán)參數(shù)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

1.4.2結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)分析后圖像的相關(guān)的數(shù)值，調(diào)整閾值線，使得各項(xiàng)參數(shù)符合質(zhì)量控制的要求，將實(shí)驗(yàn)的結(jié)果傳至LIS系統(tǒng)上

2.兩組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

A組的實(shí)驗(yàn)從2020年1月至2020年4月，總共做了20次。B組的實(shí)驗(yàn)從2021年3月至2021年4月，總共做了23次，取結(jié)果最接近的20次結(jié)果與A組進(jìn)行比較，兩組的檢測結(jié)果如下表所示：

3.結(jié)論

近年來，各實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件都有了很大的改善，使得實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本保存的時(shí)間更長，有報(bào)道-20℃保存標(biāo)本3個(gè)月對(duì)HBV-DNA熒光定量檢測無顯著的影響[1]，但是若遇到特殊情況或科研的需要，往往需將標(biāo)本保存更長的時(shí)間，收集一定數(shù)量的標(biāo)本來進(jìn)行研究探討，但是保存時(shí)間長達(dá)1年以上是否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，需要進(jìn)一步的研究探討。由上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，-20±5℃的條件下保存標(biāo)本，1年以后用同樣的試劑和方法進(jìn)行HBV DNA定量熒光檢測，A組20次的平均值是4.836×103IU/ml，B組20次的平均CT值是2.646×103IU/m，雖然結(jié)果都是10的3次方，但是結(jié)果還是有明顯的下降，將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.001，結(jié)果有顯著的差異。這樣的結(jié)果可能對(duì)于臨床治療用藥及效果監(jiān)測的影響不是特別大，但要是用于科研或者特殊需要，還是有很大的影響。檢測結(jié)果下降的原因可能是：（1）這兩組實(shí)驗(yàn)是在不同的儀器上進(jìn)行的，由于儀器的性能有所差異導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。下次研究最好能在同一臺(tái)儀器上進(jìn)行，而且儀器需要定期校準(zhǔn)，校準(zhǔn)合格、儀器狀態(tài)良好的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（2）由于標(biāo)本保存時(shí)間較長，中途可能出現(xiàn)停電導(dǎo)致冰箱內(nèi)溫度的變化，標(biāo)本存在反復(fù)凍融的情況，從而導(dǎo)致HBV DNA熒光定量檢測的結(jié)果有所下降。（3）標(biāo)本保存時(shí)間比較長，乙型肝炎病毒的DNA在一定程度上可能會(huì)有所降解，降解的幅度與保存時(shí)間長短的關(guān)系有待研究。另外，在-20℃與-70℃兩種不同的條件下保存，核酸的穩(wěn)定性關(guān)系，也有待于研究。（4）可能是選擇研究標(biāo)本的原因，此次選擇定量值是n×103的標(biāo)本，本試劑盒的定量線性范圍是1.0×102～5.0×109IU/ml，在此范圍內(nèi)，此標(biāo)本濃度值相對(duì)來說是低值，檢測值下降可能會(huì)比較明顯，如果選擇中值、高值的標(biāo)本下降可能沒這么明顯，為了讓檢測結(jié)果更具可比性，還應(yīng)該選擇中值和高值的標(biāo)本一起平行試驗(yàn)進(jìn)行分析。所以如果科研或者特殊需要的情況下，需要將標(biāo)本保存更長的時(shí)間來檢測HBV DNA的含量，就需選擇更合適的條件和方式來保存標(biāo)本，使得結(jié)果更加的穩(wěn)定，更具科研價(jià)值，為我國乙肝病毒的檢測和乙型肝炎的患者的治療及監(jiān)測做貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

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廣西科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院?廣西柳州?545002