小鼠肝細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)的研究

一、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞培養(yǎng)是用無(wú)菌操作的方法，將動(dòng)物體內(nèi)的組織取出，模擬體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動(dòng)物體內(nèi)獲取的細(xì)胞，組織和器官，用無(wú)菌操作的方法，經(jīng)銷化，分散成為單個(gè)游離的細(xì)胞。在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長(zhǎng)及繁殖。傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞自從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。

這次實(shí)驗(yàn)我所用的抗生素瓶和小玻璃珠便用于細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。本來(lái)這次實(shí)驗(yàn)用小玻璃珠，這種模式融匯了擴(kuò)大貼壁面積和便于觀察的優(yōu)點(diǎn)，并且重演性好。

二、材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

乳鼠10只，體質(zhì)量7～8g，剛出生三天，保持室溫20℃～25℃;

（二）實(shí)驗(yàn)器材

空的抗生素瓶 玻璃珠 眼科剪 眼科鑷 試管 吸管等

（三）實(shí)驗(yàn)試劑

磷酸緩沖液（PBS）;平衡鹽液：Hank原液 Hank液;細(xì)胞消化液：0.5%胰蛋白酶和0.4%EDTA鈉鹽液。以上溶液經(jīng)包裝，滅菌后備用

三、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）試劑的配制

1.Hank原液與Hank液的配制

配制程序：

（1）稱取1.4g Hank原液，溶于30～50ml的蒸餾水中。

（2）取1000ml燒杯及容量瓶各一個(gè)，先放蒸餾水800ml于燒杯中，然后逐一稱取藥品，但必須在前一藥品溶解后，方可加入下一藥品，充分混勻后，分裝，蓋緊瓶蓋，寫好標(biāo)簽，置于4°C冰箱保存。

2.胰蛋白溶液的配制

3.0.02%的EDTA鈉鹽溶液的配制

4.水解乳蛋白—Hank液的配制

5.E-MEM營(yíng)養(yǎng)液的配制

6.104U/ml青霉素、鏈霉素的配制

（二）實(shí)驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)液的配制

1.原代細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液的配制

2.傳代細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液的配制

（三）培養(yǎng)器皿

1.玻璃漏斗式濾器

玻璃漏斗式濾器將濾板與玻璃漏斗燒結(jié)成一體，適用于各種培養(yǎng)用液的過(guò)濾除菌，但不宜血清等粘稠液體。

2.手術(shù)器械

主要用于解剖動(dòng)物，取材和原代培養(yǎng)中切割組織。各種器械至少需配置兩套

3.培養(yǎng)瓶

用于原代培養(yǎng)的需要卡氏瓶10～15瓶，而傳代培養(yǎng)需用12～25個(gè)卡氏瓶，另準(zhǔn)備5瓶抗生素瓶，每次用完后，清洗時(shí)一定要徹底，以防下次用時(shí)污染。

4.其他器皿

無(wú)論是燒杯量筒還是錐形瓶等，每種至少要準(zhǔn)備四個(gè)以上，用于配藥，裝廢液等

（四）肝細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程

1.原代細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程

（1）操作者首先進(jìn)行手的清洗與消毒，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置一個(gè)酒精燈，并用酒精擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)，將小鼠放置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，解剖前用酒精棉擦拭鼠體。

（2）取材

①用鑷子將乳鼠的脊柱夾短

②用解剖刀切開(kāi)腹部，找尋乳鼠肝臟，為三瓣、半個(gè)手指大小

③用彎頭眼科鑷取出肝臟，置于注有Hank液的小燒杯中

（3）剪碎

用眼科剪將肝臟剪碎，盡量細(xì)致地剪，大約1mm2大小的塊，大小盡量均勻一致，然后用Hank液洗滌2～3次，直到液體澄清為止。

（4）消化及分散組織塊

將上步清洗的Hank液吸掉，加入0.25%胰蛋白液。置于37°C水浴中進(jìn)行消化，消化時(shí)間在20～30min左右。每隔十分鐘搖動(dòng)一次小燒杯（其中最好放幾粒玻璃珠），以便組織塊散開(kāi)，以便繼續(xù)消化，直到組織塊變成松散、粘稠狀，并且，顏色略微變?yōu)榘咨珵橹?。放在離心機(jī)中離心，吸去上清液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，直到散成混淆的細(xì)胞懸液為止。

（5）計(jì)數(shù)及稀釋

從上步的細(xì)胞懸液中吸取1ml細(xì)胞液，進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞液滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后用營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

（6）分裝及培養(yǎng)

將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中（一般為5ml/卡氏瓶），蓋上瓶蓋，切勿太緊，以免不透氣。在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)簽，注明細(xì)胞，及日期，然后置于37oC，5%濃度CO2的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

（7）觀察：每日進(jìn)行觀察

四、結(jié)果與分析

（一）結(jié)果

原代第一次實(shí)驗(yàn)

總結(jié)：這次接種后細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)原代培養(yǎng)宣告失敗，失敗的原因有以下幾種可能：

①培養(yǎng)液配制的濃度不夠，導(dǎo)致培養(yǎng)液失效

②接種濃度不夠，因?yàn)橐恢蝗槭蠊步臃N了30瓶，之后又沒(méi)有計(jì)數(shù)，很可能是濃度不夠

③胰蛋白酶的活性弱

其中，②、③步的可能性最大，應(yīng)予以注意。

本次實(shí)驗(yàn)唯一的成功之處就是滅菌情況良好，污染率為0

原代第二次實(shí)驗(yàn)：

總結(jié)：第二次實(shí)驗(yàn)鏡檢，雖然細(xì)胞已貼壁，但仍有未完全消化的細(xì)胞團(tuán)，說(shuō)明胰蛋白酶的消化還是效果不佳，雖然我已經(jīng)延長(zhǎng)了消化時(shí)間，但還是不理想;

第一次傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：

總結(jié)：雖然細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)正常，但是細(xì)胞數(shù)目少，而且未連成片，可能是培養(yǎng)的時(shí)間短，或者是在進(jìn)行傳代接種時(shí)細(xì)胞流失過(guò)多所致;

第二次傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：

總結(jié)：細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)較上一次良好，抗生素小瓶中仍不好觀察，但能模糊看到細(xì)胞有貼壁生長(zhǎng)，數(shù)量還是很多，所以，本次仿效微載體的方案成功，但較微載體偏少。

（二）分析

照片中所呈現(xiàn)的圓球形顆粒就是細(xì)胞，大部分細(xì)胞連接成片，個(gè)別細(xì)胞形狀不規(guī)則，有的還可觀察到細(xì)胞分裂，從原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的比較中，可看到傳代培養(yǎng)的細(xì)胞體積較原代的要小，密度也小，這可能是我們所提供的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境還沒(méi)有完全達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，還有就是一些操作中的問(wèn)題。

遼寧省海城市南臺(tái)高級(jí)中學(xué) 李維維