冷凍干燥法制備孔雀石綠降解菌劑及其應(yīng)用效果研究

（上海市水產(chǎn)研究所，上海 200433）

孔雀石綠（Malachite green，MG）在漁業(yè)養(yǎng)殖中作為一種殺菌劑被廣泛使用[1-2]。由于其價(jià)格低廉、抗菌效果顯著，且沒有更好的替代藥物，盡管各國已將其列入水產(chǎn)養(yǎng)殖的禁用藥物名單，但違規(guī)使用孔雀石綠藥物的情況屢見不鮮、屢禁不止，在水產(chǎn)品抽樣檢查中發(fā)現(xiàn)孔雀石綠仍然存在殘留超標(biāo)現(xiàn)象[3]。陜西省對(duì)2017 年和2018 年的水產(chǎn)品抽樣調(diào)查顯示，孔雀石綠連續(xù)兩年均有較高檢出率[4]，殘留風(fēng)險(xiǎn)較高。在漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)中，漁業(yè)生態(tài)環(huán)境中孔雀石綠藥物殘留情況較為突出[5]，程杏安等[6]對(duì)珠三角地區(qū)的10 個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，10 個(gè)取樣點(diǎn)的底泥均有孔雀石綠殘留，殘留量最高達(dá)0.030 7 g·g-1，其中有3個(gè)取樣點(diǎn)底泥有代謝產(chǎn)物隱性孔雀石綠（Leucomalachite green，LMG）殘留，殘留量在0.007 3～0.030 9 g·g-1之間。安全有效地去除漁業(yè)環(huán)境中的孔雀石綠藥物殘留已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域亟待解決的問題。

在自然環(huán)境中，孔雀石綠和隱性孔雀石綠穩(wěn)定性較差，受環(huán)境中氧化還原物質(zhì)的影響，極易互相轉(zhuǎn)化[7-8]，兩者共同殘留在環(huán)境中，對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成極大威脅。目前對(duì)環(huán)境污染物的修復(fù)主要有物理、化學(xué)和生物法，相比其他修復(fù)方式，微生物修復(fù)效果好、成本低廉、無二次污染，符合綠色環(huán)保理念。微生物修復(fù)制劑主要分為液態(tài)菌劑和固態(tài)菌劑，液態(tài)菌劑存在運(yùn)輸不便且容易受污染等缺點(diǎn)，而固態(tài)菌劑在運(yùn)輸、貯藏和質(zhì)量控制等方面都優(yōu)于液態(tài)菌劑，其貯存成本較低，易于大型化、自動(dòng)化、工業(yè)化生產(chǎn)[9]，因此，固態(tài)微生物菌劑越來越受到關(guān)注。但是，國內(nèi)目前對(duì)固態(tài)菌劑的研究主要集中于一些益生菌[10-11]，且其存在細(xì)胞存活率不高的問題，菌劑活性差，應(yīng)用效果不理想。

目前，國內(nèi)外對(duì)孔雀石綠的降解研究較多[12-13]，但因我國養(yǎng)殖水域分布廣泛，且對(duì)生物修復(fù)漁業(yè)藥物殘留的宣傳力度不夠，生物降解技術(shù)尚未發(fā)揮出應(yīng)有的效果。本課題組前期研究分離獲得的D3（Citrobactersp.）和D6（Enterobactersp.）兩株孔雀石綠降解菌對(duì)孔雀石綠降解率超過95%，并對(duì)其酸性還原產(chǎn)物隱性孔雀石綠降解效果理想，這為復(fù)合型降解菌劑的制備提供了良好的菌種來源。本研究旨在將兩株孔雀石綠降解菌株通過冷凍干燥法制備成復(fù)合型降解菌劑，通過優(yōu)化制備工藝，獲得高性能的孔雀石綠降解菌劑，以解決目前微生物菌劑普遍活性不高、運(yùn)輸不便、不易長(zhǎng)期保存等缺點(diǎn)，并將制備的菌劑初步應(yīng)用于漁業(yè)養(yǎng)殖水體及底泥環(huán)境，考察菌劑的實(shí)際應(yīng)用效果，以期為利用微生物修復(fù)漁業(yè)生態(tài)環(huán)境中的孔雀石綠藥物殘留提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：島津LC-20AD 液相色譜儀；AB SCIEX QTRAP?6500 質(zhì)譜聯(lián)用儀；渦旋振蕩器（IKA MS3）；超純水機(jī)（美國Millipore公司）；Centrifuge 5810R型離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒，THZ-100）

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品：孔雀石綠和隱性孔雀石綠購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。氘代顯性孔雀石綠（Malachite green-D5，MG-D5）和氘代隱性孔雀石綠（Leucomalachite green-D6，LMG-D6）購自德國WITEGA公司。

供試菌種：孔雀石綠降解菌株D3（Citrobactersp.）和D6（Enterobactersp.）

營養(yǎng)培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉劑3.0 g，氯化鈉5.0 g，葡萄糖1.0 g，過濾養(yǎng)殖水體1 000 mL，pH 7.6～7.8，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）后制得。

試劑：蔗糖（國藥集團(tuán)）、脫脂乳（美國BD 公司）、甘油（麥克林公司）

供試漁業(yè)養(yǎng)殖水體采自上海市水產(chǎn)研究所內(nèi)養(yǎng)殖池塘，水體pH 7.1。

供試漁業(yè)養(yǎng)殖底泥采自上海市郊區(qū)某養(yǎng)殖池塘，其部分理化性質(zhì)如下：pH 6.5，有機(jī)質(zhì)含量14.22 g·kg-1，電導(dǎo)率178.3 μS·cm-1，粒徑≤0.3 mm。

1.2 菌體的培養(yǎng)及菌懸液的制備

菌種活化后，將對(duì)數(shù)期的菌種以1%的接種量接種至營養(yǎng)培養(yǎng)基，30 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間12 h，采用平板稀釋涂布的方法對(duì)菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，獲得菌劑制備前的菌落數(shù)。富集培養(yǎng)后的菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，8 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，磷酸緩沖鹽洗滌后，再次離心棄上清，獲得菌體。將凍干保護(hù)劑與菌體按照不同配比進(jìn)行混合，制備成不同條件的菌懸液，備用。

1.3 凍干劑的制備

將制備好的菌懸液分裝，放入-80 ℃的冰箱進(jìn)行預(yù)冷凍24～48 h，冷凍完全后放入凍干機(jī)中，真空冷凍干燥16 h。

1.4 菌體成活率檢測(cè)

測(cè)定凍干后的菌劑質(zhì)量，復(fù)溶至與菌體來源完全相等的無菌水中，搖勻使其充分溶解，30 ℃水浴30 min，采用平板稀釋涂布法對(duì)其進(jìn)行有效活菌計(jì)數(shù)，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時(shí)間與凍干前計(jì)數(shù)平板培養(yǎng)時(shí)間相同。

式中：Nt為凍干后有效活菌數(shù)；N0為凍干前有效活菌數(shù)。

1.5 制備復(fù)合菌劑的方法優(yōu)化

分別對(duì)凍干保護(hù)劑的配比、菌體含量、預(yù)冷凍時(shí)間和冷凍厚度等因素進(jìn)行優(yōu)化，菌劑性能優(yōu)良程度以菌體成活率為標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)參照菌劑的外觀特征進(jìn)行判定。在凍干過程中查閱大量文獻(xiàn)初步篩選出5 種適用于本菌的凍干保護(hù)劑配方，詳細(xì)的菌劑制備方法及配比如表1所示。

1.6 復(fù)合菌劑在漁業(yè)環(huán)境中的初步應(yīng)用研究

室內(nèi)模擬自然環(huán)境，將制備好的菌劑投灑到漁業(yè)水體及底泥環(huán)境中，監(jiān)測(cè)菌劑在水體及底泥中對(duì)孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱性孔雀石綠的降解情況，對(duì)菌劑制劑的實(shí)際應(yīng)用效果進(jìn)行初步探究。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：取適量菌劑于水體中30 ℃水浴活化，均勻投灑到藥物濃度為5 mg·L-1的養(yǎng)殖水體中，菌劑投灑量約0.01 g·L-1，控制環(huán)境溫度25 ℃左右，分別在12、24 h和5 d后監(jiān)測(cè)孔雀石綠藥物殘留。底泥實(shí)驗(yàn)設(shè)置孔雀石綠濃度為2 mg·kg-1，菌劑投加量約為1 g·kg-1，中間追加一次菌劑投放，實(shí)際環(huán)境溫度約20 ℃，保持底泥適當(dāng)水分，分別在第3、5、7、13 d 和25 d 定時(shí)取樣監(jiān)測(cè)。設(shè)置空白（CK）、光照（L）、菌劑（BA）和菌劑+光照（L+BA）進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，光照條件均為自然光，三組平行，其降解率計(jì)算公示如下：

式中：X為降解率；Xt為降解后底泥中藥物殘留濃度；X0為原始添加濃度。

1.7 菌劑對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中魚體生長(zhǎng)影響

選擇體長(zhǎng)10～12 cm 草魚為研究對(duì)象，投加菌劑于養(yǎng)殖水箱中，使其濃度分別為0.01、0.03、0.05 g·L-1和0.10 g·L-1，菌劑預(yù)活化3 h，每組試驗(yàn)投放魚體50尾，期間不換水，泵氧，養(yǎng)殖1 周，考察菌劑對(duì)魚體存活影響，每個(gè)梯度設(shè)置三組平行，設(shè)置空白對(duì)照（CK）。

1.8 孔雀石綠檢測(cè)方法

水體檢測(cè)方法：8 000 r·min-1離心，0.45 μm 濾膜過濾，取適量水體加入氘代孔雀石綠及氘代隱性孔雀石綠內(nèi)標(biāo)。樣品采用PRS固相萃取柱進(jìn)行富集回收，分別用2 mL 乙腈、2 mL 水活化，采用2 mL 水和2 mL乙腈進(jìn)行淋洗，最后使用3 mL 乙腈∶乙酸銨（V∶V=1∶1）洗脫，取1 mL 洗脫液過0.22 μm 濾膜后，通過HPLC-MS/MS進(jìn)行分析[14]。

底泥檢測(cè)方法：稱取底泥2 g，加入氘代孔雀石綠及氘代隱性孔雀石綠內(nèi)標(biāo)，使用15 mL 乙腈超聲、渦旋，提取兩次，合并提取液，8 000 r·min-1離心，取2 mL 上清液過PRS 固相萃取柱進(jìn)行富集，PRS 柱使用2 mL 乙腈活化，2 mL 乙腈進(jìn)行淋洗，最后使用4 mL乙腈∶乙酸銨（V∶V=1∶1）洗脫，取1 mL 洗脫液過0.22 μm濾膜后，通過HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。

1.9 數(shù)據(jù)處理方法

采用IBM SPSS Statistics 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和計(jì)算，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以3 次重復(fù)的平均值表示，差異顯著性分析采用LSD 法、S-N-K 法和重復(fù)測(cè)量方差分析，顯著性水平設(shè)定為α=0.05，極顯著水平設(shè)定為α=0.01。

表1 菌劑制備方法優(yōu)化配比Table 1 Optimization of preparation method of bacterial agent

2 結(jié)果與分析

2.1 離心速度對(duì)菌體成活率的影響

菌懸液制備過程中，菌體離心速度對(duì)菌體成活率具有較大的影響，不同離心速度下菌體的成活率如圖1 所示，5 000～8 000 r·min-1時(shí)菌體成活率較為穩(wěn)定，隨著離心速度的提高，菌體成活率逐步下降。

圖1 離心速度對(duì)菌劑中菌體成活率的影響Figure 1 The effect of centrifugal speed on the survival rate of bacteria

2.2 不同制備方法對(duì)菌劑外觀形態(tài)的影響

采用不同方法制備的孔雀石綠復(fù)合菌劑如圖2所示，從外觀形態(tài)來看，方法3、方法4 和方法5 獲得的降解菌劑外觀細(xì)膩、色澤均勻、質(zhì)地疏松飽滿，方法1獲得的菌劑外觀略顯粗糙、不平，方法2制備的菌劑有黏稠狀大顆粒。

2.3 不同制備方法對(duì)菌體成活率的影響

采用不同制備方法獲得復(fù)合降解菌劑的菌體成活率如圖3所示。由圖3可知，方法1、方法2和方法5菌體成活率均在80%以上，明顯高于方法3和方法4，尤其是方法1 和方法2 的菌體成活率高達(dá)95%以上，從菌劑制備配方可以發(fā)現(xiàn)，菌體含量越低，凍干保護(hù)劑含量越高，獲得的降解菌劑菌體成活率越高，與方法1相比，方法4降低了凍干劑的含量，同時(shí)提高了菌體含量，其獲得的菌劑菌體成活率由97.6%降為21.4%。這說明凍干保護(hù)劑對(duì)菌劑制劑的菌體成活率具有至關(guān)重要的作用，但是過度提高凍干劑的比例，其缺點(diǎn)也很明顯，獲得的菌劑往往外觀形態(tài)不理想，菌劑易粗糙、粘連，且造成資源浪費(fèi)，制備成本高。

不同凍干劑對(duì)菌劑菌體成活率影響較大，不同配方的凍干保護(hù)劑制備獲得的菌劑見圖2 和圖3，相同的菌體含量下，混合配比的凍干保護(hù)劑比單一的凍干保護(hù)劑效果更理想，菌體含量和凍干劑只有在合理的配比范圍，才能獲得外觀均勻、細(xì)膩的菌劑。優(yōu)良的菌劑以質(zhì)地均勻細(xì)膩、菌體成活率高為佳，綜上，方法5 制備的菌劑為最優(yōu)菌劑，將其應(yīng)用于下一階段的試驗(yàn)研究。

圖2 五種不同制備方法獲得的復(fù)合菌劑外觀形態(tài)Figure 2 The appearance of the compound bacterial agent obtained by five different preparation methods

圖3 制備方法對(duì)菌劑中菌體成活率的影響Figure 3 The effect of preparation methods on the survival rate of bacteria

2.4 菌劑在漁業(yè)水體中應(yīng)用效果

孔雀石綠易溶于水，漁業(yè)環(huán)境中未被代謝的藥物極易在漁業(yè)水體中殘留，試驗(yàn)將制備的孔雀石綠降解菌劑投入到漁業(yè)養(yǎng)殖水體中，考察菌劑對(duì)孔雀石綠的降解效果（表2）。

表2顯示，避光處理（CK）的孔雀石綠降解較為緩慢，5 d 后降解率僅為22.21%。增加自然光照后，孔雀石綠的降解率大幅提高，5 d降解率可超過95%，說明光照對(duì)孔雀石綠有降解效果。而無光照處理僅有菌劑的情況下，孔雀石綠5 d 后的降解率同樣超過95%，但菌劑對(duì)孔雀石綠的降解效率更快，24 h 降解效果就達(dá)到87.58%。相同條件下添加菌劑并光照處理，5 d后孔雀石綠的降解率提高到99%以上，而且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示12 h降解率即超過90%，光照對(duì)提高菌劑降解效率具有極顯著影響（P＜0.01）。從水體中隱性孔雀石綠的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠在降解過程中有隱性孔雀石綠產(chǎn)生，5 d 后光照處理組隱性孔雀石綠的生成量顯著低于無光照處理組。

表2 不同條件下菌劑對(duì)漁業(yè)養(yǎng)殖水體中MG的降解Table 2 Degradation of MG in aquaculture water under different conditions

2.5 菌劑在漁業(yè)底泥中應(yīng)用效果

孔雀石綠等藥物進(jìn)入水體環(huán)境后，未被分解的孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱性孔雀石綠大部分被底泥吸附和吸收，即底泥沉積物是大部分藥物的最后歸宿和載體?？紤]到兩種藥物在底泥環(huán)境中可通過氧化還原反應(yīng)互相轉(zhuǎn)化，本試驗(yàn)分別考察兩種藥物在底泥的殘留降解情況。將制備的菌粉制劑投撒到漁業(yè)養(yǎng)殖底泥，不同條件下菌劑對(duì)漁業(yè)養(yǎng)殖底泥中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的降解率如圖4所示。

從圖4a 可以發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠在底泥中幾乎很難降解，25 d 后避光處理CK 降解率僅為8.28%，而施加菌劑并輔以光照后其降解率高達(dá)73.36%，且光照對(duì)提高菌劑在底泥中的降解速率有極顯著影響（P＜0.01），這一點(diǎn)類似于菌劑在養(yǎng)殖水體中的降解。圖4b顯示，25 d后底泥中隱性孔雀石綠的去除效果與孔雀石綠在底泥中的降解效果類似，均為使用菌劑并輔以光照的降解效果最理想，25 d其藥物降解率最高可達(dá)76.80%，避光條件下隱性孔雀石綠仍然得到一定的降解，這可能與底泥環(huán)境微生物含量豐富有關(guān)。

圖4 不同條件下菌劑對(duì)漁業(yè)養(yǎng)殖底泥中MG和LMG的降解率Figure 4 Degradation rate of MG and LMG in fishery bottom mud under different conditions

在研究孔雀石綠及隱性孔雀石綠在底泥中降解過程的同時(shí)，跟蹤監(jiān)測(cè)其在底泥中隱性孔雀石綠和孔雀石綠的生成量，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 數(shù)據(jù)顯示，在孔雀石綠降解過程中，避光條件下隱性孔雀石綠的殘留量極顯著高于光照條件下（P＜0.01），說明避光條件下孔雀石綠更容易被還原為隱性孔雀石綠，這可能與底泥環(huán)境中天然存在的一些氧化還原微生物有關(guān)。在隱性孔雀石綠降解過程中，未添加菌劑組孔雀石綠的殘留量極顯著高于添加菌劑組（P＜0.01），說明添加降解菌劑的底泥可降低底泥中孔雀石綠的產(chǎn)生。綜上，無論是加速孔雀石綠和隱性孔雀石綠在底泥中的降解，還是減弱二者在底泥中的相互轉(zhuǎn)化，增加光照輔加菌劑的作用效果均較好。

2.6 菌劑對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中魚體存活的影響

不同菌劑濃度下草魚死亡數(shù)如表4 所示，7 d 內(nèi)未添加菌劑組，草魚死亡4 尾，添加菌劑組草魚死亡3～5 尾，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，分析結(jié)果顯示，球形檢驗(yàn)P=0.021＜0.05，不服從球形假設(shè)，參看多變量檢驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示所有P值均大于0.05，因此得出結(jié)論，菌劑對(duì)魚體死亡無顯著影響（P＞0.05），時(shí)間對(duì)魚體生長(zhǎng)無顯著影響（P＞0.05），各處理組和對(duì)照組在不同時(shí)間魚體的死亡數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

在低離心速度下，菌體成活率穩(wěn)定，隨著離心速度的提高，菌劑中菌體成活率逐漸下降，這是由于隨著離心速度的提高，轉(zhuǎn)速會(huì)使細(xì)胞造成損傷甚至破碎，后經(jīng)過預(yù)冷凍及真空干燥等環(huán)節(jié)處理，菌體存活率下降。低離心率不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，因此對(duì)菌體成活率影響不大，但是離心率過低，容易導(dǎo)致菌體細(xì)胞大部分置于上清液中，菌體回收率降低，造成資源浪費(fèi)，綜合考慮菌體的回收率及菌體存活率情況，在制備孔雀石綠降解菌劑過程中，菌體離心速度設(shè)置為8 000 r·min-1較為合理。

方法1 制備獲得的菌劑外觀略顯粗糙、不平，這是由于菌劑配方中含有過量的脫脂乳，而菌體含量不足。方法2 制備的菌劑有黏稠狀大顆粒，這主要是由于制備過程中添加甘油過量，且菌體含量低，凍干保護(hù)劑與菌體配比不合理。凍干保護(hù)劑的種類和配方對(duì)菌體成活率和菌劑形態(tài)有重要影響，多種類的保護(hù)劑比單一的保護(hù)劑效果更理想，不同配方的保護(hù)劑需要結(jié)合菌體含量進(jìn)行配方優(yōu)化。菌劑制備過程中的凍干厚度和預(yù)冷凍時(shí)間也是菌劑制備優(yōu)良的關(guān)鍵因素[15-16]。凍干厚度低，在預(yù)冷凍轉(zhuǎn)至冷凍干燥時(shí)容易溶化，之后再次凍結(jié)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不同程度的損傷，且冷凍抽真空過程中易產(chǎn)生鼓泡現(xiàn)象，鼓泡會(huì)傷害菌體細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，菌體死亡；而凍干厚度高，則不容易溶化，菌體損傷較少，菌體存活率高；如果凍干厚度過大，單位體積的細(xì)胞過多，使結(jié)合水不易損失而影響凍干過程中干燥的時(shí)間，導(dǎo)致真空冷凍干燥時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)菌體成活率產(chǎn)生負(fù)面影響。預(yù)冷凍一般在-80 ℃條件下進(jìn)行，預(yù)冷凍時(shí)間與凍干厚度相關(guān)聯(lián)，凍干厚度越高，預(yù)冷凍時(shí)間越長(zhǎng)，真空冷凍干燥時(shí)間越長(zhǎng)。所以只有掌握合適的預(yù)冷凍時(shí)間和凍干厚度才能獲得合理的真空冷凍干燥時(shí)間，合理節(jié)約資源，控制菌劑制備成本。綜合分析，采用方法5 制備獲得的孔雀石綠降解菌劑外觀良好，菌劑細(xì)膩，菌體成活率約為82.3%，為最佳菌劑。

表3 不同處理?xiàng)l件下漁業(yè)養(yǎng)殖底泥中MG和LMG的生成量（mg·kg-1）Table 3 The production of MG and LMG in fishery bottom mud under different treatment（mg·kg-1）

表4 不同菌劑濃度下各時(shí)間魚體死亡數(shù)Table 4 The number of fish death under different concentrations of bacterial agents at the different time

菌劑性能優(yōu)良程度主要從產(chǎn)品外觀形態(tài)和菌體成活率來判斷，影響菌體成活率的因素有很多，如菌體培養(yǎng)時(shí)間、預(yù)冷凍溫度、保護(hù)劑的pH 等[17]，本試驗(yàn)僅測(cè)定了部分質(zhì)量指標(biāo)，菌劑配方仍需繼續(xù)優(yōu)化，開展大量實(shí)驗(yàn)，確定生產(chǎn)菌劑的最佳工藝條件，以期獲得最大經(jīng)濟(jì)效益，后續(xù)試驗(yàn)可以通過測(cè)定不同時(shí)間產(chǎn)品的有效活菌數(shù)來判斷產(chǎn)品的保質(zhì)期，結(jié)合菌劑配方合理延長(zhǎng)菌劑制劑的保質(zhì)期，最后進(jìn)行產(chǎn)品的生產(chǎn)包裝和銷售。

降解菌劑在降解水體中孔雀石綠的過程中，光照對(duì)降解效率有明顯的促進(jìn)作用。降解菌劑在有光照的情況下可以提高其降解孔雀石綠的速率，藥物去除率更高。菌劑使用時(shí)需將其溶解于適量水體中活化，然后均勻投灑到水體環(huán)境中，該配方菌劑在水體中投灑量約為0.01 g·L-1，在實(shí)際應(yīng)用過程中可根據(jù)環(huán)境中的藥物殘留濃度適量增減菌劑的投加量。

降解菌劑降解底泥中孔雀石綠過程中，在投加菌劑的同時(shí)輔加光照可以提高其降解速率，且能有效避免孔雀石綠過多地轉(zhuǎn)化為隱性孔雀石綠。菌劑制劑在應(yīng)用到底泥環(huán)境前同樣需要先活化，之后均勻投灑到底泥中，本試驗(yàn)條件下菌劑投灑量約為1 g·kg-1，由于本試驗(yàn)研究是在冬季開展，天氣較為陰冷且日照不足，其最高降解率為70%以上，根據(jù)前人的研究經(jīng)驗(yàn)，夏季氣溫高、光照充足時(shí)，微生物活性高，更有利于菌劑對(duì)藥物的降解[18]，其降解效果會(huì)更理想。

本研究獲得的降解菌劑由于含有脫脂乳，在實(shí)際應(yīng)用過程中經(jīng)濟(jì)成本偏高，選擇更合適的替代品是接下來的研究方向，將孔雀石綠降解菌利用凍干工藝制備成微生物菌劑并商品化，對(duì)解決實(shí)際漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境中的孔雀石綠藥物殘留問題具有重要意義。

4 結(jié)論

（1）本研究以15%脫脂乳、10%蔗糖和甘油作為凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑與菌體配方比例分別為15、5 mL·g-1和0.25 mL·g-1，凍干厚度0.4 cm，預(yù)冷凍時(shí)間48 h，真空冷凍干燥16 h，該條件下制備的菌劑制劑外觀性能良好，色澤均勻、細(xì)膩，菌體成活率高達(dá)80%以上。

（2）本試驗(yàn)將獲得的孔雀石綠菌劑制劑在漁業(yè)養(yǎng)殖水體及底泥中小規(guī)模試驗(yàn)，效果顯著，光照條件下，菌劑對(duì)漁業(yè)養(yǎng)殖水體中濃度為5 mg·L-1的孔雀石綠12 h降解率超過90%，對(duì)漁業(yè)底泥中濃度為2 mg·kg-1的孔雀石綠及代謝產(chǎn)物隱性孔雀石綠25 d 降解率分別為73.36%和76.80%。

（3）添加降解菌劑可有效減弱底泥中隱性孔雀石綠向孔雀石綠轉(zhuǎn)化，而增加光照又能抑制孔雀石綠轉(zhuǎn)化為隱性孔雀石綠，因此增加光照輔加菌劑無論是對(duì)孔雀石綠還是隱性孔雀石綠在底泥中的降解都有促進(jìn)作用。

（4）菌劑對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中的魚體生長(zhǎng)無顯著影響，投加菌劑不會(huì)導(dǎo)致魚體死亡率提高。