蓖麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)重金屬Zn2+的脅迫響應(yīng)※

●尹明達(dá) 羅 蕊 包春光 孟祥越 孫 雪 王凡浩 賈崇寧 李正彩 張圓圓 黃鳳蘭,3,4,5,6,7※※

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院 內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.通遼市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心 內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.蓖麻育種國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)蒙古 通遼 028000；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心 內(nèi)蒙古 通遼 028000；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)蒙古 通遼 028000；6.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 內(nèi)蒙古 通遼 028000；7.蓖麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心 內(nèi)蒙古 通遼 028000）

蓖麻（Ricinus communisL.）屬雙子葉植物綱、大戟目、大戟科、蓖麻屬草本植物[1]，是重要的油料作物，在生態(tài)修復(fù)、醫(yī)藥前體開發(fā)、生物防治等領(lǐng)域具有很高的開發(fā)利用價(jià)值[2]。蓖麻耐旱、耐瘠薄，適應(yīng)性強(qiáng)，不與糧棉爭(zhēng)地，地邊拐角均可栽植，因此我國(guó)的蓖麻資源十分豐富且分布廣泛[3]。

鋅是所有生物體必需的元素，它密切參與植物體內(nèi)的各種生命代謝活動(dòng)[4]。對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，鋅有利于植物生長(zhǎng)素的形成，還有增強(qiáng)抗逆性的作用。植物缺鋅會(huì)導(dǎo)致植株短小、葉片的擴(kuò)展與伸長(zhǎng)受到限制、節(jié)間短[5]，但并不是說(shuō)鋅的濃度越高植物生長(zhǎng)就越好。對(duì)植物幼苗來(lái)說(shuō)，吸取過(guò)量的鋅會(huì)明顯降低葉綠素含量，且會(huì)嚴(yán)重影響植物根和葉片的生長(zhǎng)。現(xiàn)階段，鋅礦的開采、鍍鋅、儀器儀表及機(jī)械制造等工業(yè)活動(dòng)，各種化工廠排放的工業(yè)廢水中都含有大量的Zn2+，燃煤的煙塵中的鋅含量也常超標(biāo)，會(huì)對(duì)土壤、水源和大氣造成嚴(yán)重污染[6]。鋅污染會(huì)破壞土壤的結(jié)構(gòu)與功能；還會(huì)影響土壤的理化性狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)威脅土壤的自然生產(chǎn)力[7]。被鋅污染的土壤中微生物的種類和數(shù)量顯著降低，土壤酶的活性被破壞[8]。鋅對(duì)水的污染更加嚴(yán)重，因?yàn)殇\對(duì)水生動(dòng)物的毒性更大，如用含鋅污水澆灌作物，會(huì)造成污染范圍擴(kuò)大。

蓖麻對(duì)各種重金屬離子有著很高的耐受性，而鋅是蓖麻生長(zhǎng)必不可少的微量元素，濃度過(guò)高的Zn2+又會(huì)對(duì)蓖麻產(chǎn)生脅迫影響。研究蓖麻對(duì)Zn2+的耐受程度及其耐受原因，對(duì)治理鋅污染土壤具有重大意義，且為后續(xù)深入開展蓖麻抗逆性研究奠定了基礎(chǔ)。本研究以‘2129’品系蓖麻為材料，對(duì)該種蓖麻種子及幼苗測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)，從而研究蓖麻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)Zn2+的耐受程度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料‘2129’品系的蓖麻種子，由內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 設(shè)備與器具設(shè)備：各種型號(hào)移液器、分析電子天平EP214Dcd、高速大容量低溫離心機(jī)（multifuge X3）、小型高速低溫離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5424 R）、 酶 標(biāo) 儀（infinite M200 pro）、HVE-50 型高溫高壓滅菌鍋、超低溫冷凍冰箱（Thermo Scientific Forma 702）。

器 具：1.5mL、4mL、15mL 離 心 管，30mL玻璃試管，50mL、100mL、500 mL、1 000mL 容量瓶，100mL、1 000mL 燒杯，玻璃棒，石英管，1 300mL 圓形塑料培養(yǎng)盒，直徑100mm 陶瓷研缽及缽杵。

1.1.3 試劑七水合硫酸鋅（Z nSO4·7H2O）、液氮、愈創(chuàng)木酚、30% H2O2、20% TCA、0.5%TBA、PBS（pH7.8，50mm）、0.1mol/L H2O2、2mm NADPH、10mm GSSG。

1.1.4 其他干凈的蛭石、干凈無(wú)污染的黃土。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)備飽滿健康的蓖麻種子若干，蛭石若干，黃土若干，1 300mL 圓形塑料培養(yǎng)盒17 個(gè)，濾紙。將圓形塑料培養(yǎng)盒進(jìn)行121℃、20min 高壓滅菌，取出后在每個(gè)盒蓋中間部位打若干直徑為15mm 的孔洞并將濾紙粘在上面，將孔洞全部遮住。選出1 700 粒蓖麻種子，平均分成17 份。在培養(yǎng)盒中加入大約150g 蛭石，將17 份種子分別均勻地撒在17 個(gè)培養(yǎng)盒的蛭石上，再用大約150 g 蛭石將其覆蓋。用無(wú)水硫酸鋅配制不同濃度的ZnSO4溶液，分別為120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L、600mg/L、720mg/L、840mg/L、960mg/L、1 080mg/L、1 200mg/L、1 320mg/L、1 560mg/L、1 800mg/L、2 040mg/L、2 280mg/L，每種濃度的溶液800mL。向15 個(gè)培養(yǎng)盒中澆入不同濃度硫酸鋅溶液，并做好標(biāo)記，剩余兩個(gè)培養(yǎng)盒中各加入800mL 清水，作為種子對(duì)照和栽種幼苗預(yù)備。將17 個(gè)培養(yǎng)盒放在25℃有光照的溫室中培養(yǎng)72 h。后用清水篩洗出來(lái)，并按不同處理分開擺放在干凈的桌面上。

在最后一個(gè)清水培養(yǎng)的培養(yǎng)盒中取根長(zhǎng)、大小一致的40 粒蓖麻萌發(fā)種子，播種至裝有大約1.5kg/盆黃土的花盆中，使用清水與濃度120mg/L至2 280mg/L 的ZnSO4溶液分別對(duì)幼苗進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 種子形態(tài)學(xué)觀察對(duì)上述經(jīng)過(guò)清水與濃度120mg/L 至2 280mg/L 的ZnSO4溶液培養(yǎng)過(guò)的蓖麻種子進(jìn)行觀察，并拍照保存。

1.3.2 種子發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)取上述清水與濃度120mg/L 至2 280mg/L 的ZnSO4溶液培養(yǎng)過(guò)的蓖麻種子，統(tǒng)計(jì)每份種子的萌發(fā)數(shù)量與未萌發(fā)數(shù)量，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算不同濃度處理后的種子發(fā)芽率。

1.3.3 種子生理指標(biāo)測(cè)定膜脂受損程度以及植物的抗逆性通過(guò)檢測(cè)MDA 含量來(lái)測(cè)定[9]。蓖麻種子中MDA 含量的測(cè)定原理參照張清航[10]論文中的原理。公式：

注：V1為提取液總體積（4mL）；V2為測(cè)定用的酶液體積（1mL）；W為樣品鮮重（0.4 g）。

CAT 活性的測(cè)定。過(guò)氧化氫酶主要用于催化過(guò) 氧化氫進(jìn)行反應(yīng)[11-12]。對(duì)CAT 活性的測(cè)定及其原理參照Gill S S、Quan L J 與楊節(jié)[13-15]的論文。以每分鐘 OD 值變化（減?。?.1為1個(gè)酶活性單位（U）。公式：

注：ΔA240為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應(yīng)時(shí)間（3min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V2為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（0.2mL）。

GR 的測(cè)定。對(duì)谷胱甘肽還原酶活性的測(cè)定參照劉振玉[16]論文中所述的GR 的特性來(lái)進(jìn)行測(cè)定與計(jì)算。按每克樣本每分鐘催化1μmol NADPH氧化為1 個(gè)酶活單位（U）。公式：

注：ΔA340為實(shí)驗(yàn)組在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；ΔA空白為空白組在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；ε 為NADPH 摩爾消光系數(shù)6.22×103L·mol-1·cm-1；d為比色皿內(nèi)徑（5.85mm）；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應(yīng)時(shí)間（2min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V3為反應(yīng)體系總體積（2.25mL）；V2為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（0.3mL）。

P OD 的測(cè)定。POD 活性的測(cè)定原理參照GARCíA-PONCE á L[17]等人的論文。以每分鐘OD值變化（升高）0.01 為1 個(gè)酶活性單位（U）。公式：

注：ΔA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應(yīng)時(shí)間（3min）；V1為提取酶液總體積（4 mL）；V2為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（0.02mL）。

1.3.4 幼苗形態(tài)學(xué)觀察分別取培養(yǎng)7d、15d、21d 的蓖麻幼苗的根與葉片，用清水洗凈并進(jìn)行拍照對(duì)比觀察，清洗時(shí)注意不要損壞根莖與葉片。

1.3.5 幼苗生理指標(biāo)測(cè)定葉片的生理指標(biāo)測(cè)定方法參 照1.2.1 中對(duì) 種 子MDA、CAT、GR、POD 四個(gè)指標(biāo)的測(cè)定，測(cè)定材料為四葉期處理后的新鮮葉片。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)對(duì)Zn2+的脅迫響應(yīng)

對(duì)用清水與不同濃度ZnSO4溶液處理3d 后的種子進(jìn)行觀察，蓖麻種子發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。由表1 可以看出，用不同濃度Zn2+處理的蓖麻種子的萌發(fā)程度與清水組相比差異顯著，但未表現(xiàn)出明顯規(guī)律，在Zn2+濃度達(dá)到960 mg/L 時(shí)，發(fā)芽率達(dá)到最高且顯著性差異最大。

表1 蓖麻種子發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

對(duì)種子進(jìn)行不同濃度的Zn2+處理與培養(yǎng)，3d后，蓖麻種子根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，蓖麻種子根粗統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

由表2 可以看出，與清水組相比，當(dāng)Zn2+濃度在480mg/L 以下時(shí)，種子根長(zhǎng)逐漸增長(zhǎng)；在Zn2+濃度超過(guò)480mg/L 后差異顯著，但未表現(xiàn)出明顯規(guī)律；在Zn2+濃度達(dá)到960mg/L 時(shí)，蓖麻種子的根長(zhǎng)達(dá)到最高值41.32mm。由表3 可以看出，根粗則僅在部分濃度處理時(shí)差異顯著且未出現(xiàn)明顯規(guī)律，但在Zn2+濃度大于1 320mg/L 后，根粗?jǐn)?shù)值全部低于正常數(shù)值，但沒有出現(xiàn)蓖麻種子死亡，證明蓖麻對(duì)鋅具有很高的耐性。此結(jié)果與呂冬梅[18]的研究Zn2+結(jié)果相吻合。

表2 蓖麻種子根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表3 蓖麻種子根粗統(tǒng)計(jì)結(jié)果

分別用480mg/L、720mg/L、960g/L、1 200mg/L、1 560mg/L、2 040mg/L 的ZnSO4溶液對(duì)蓖麻種子進(jìn)行培養(yǎng)，如圖1～7，圖中A 為處理后萌發(fā)的種子，B 為處理后未萌發(fā)的種子。

從圖1～4 可以看出，與清水組相比，Zn2+濃度達(dá)到720mg/L 時(shí)，蓖麻種子表面開始出現(xiàn)黃色斑塊；Z n2+濃度達(dá)到960mg/L 時(shí)斑塊明顯減少；Zn2+濃度在1 080 ～1 320 mg/L 之間時(shí)，部分種子主根明顯增長(zhǎng)，但側(cè)生根數(shù)量減少且黃色斑塊少量增加；Zn2+濃度大于1 320mg/L 時(shí)，種子表面黃色斑塊增加，主根長(zhǎng)度減小，幾乎無(wú)側(cè)生根。

由表1 可以看出，用不同濃度Zn2+處理的蓖麻種子與清水組相比差異顯著，但未表現(xiàn)出明顯規(guī)律，且在Zn2+濃度達(dá)到960 mg/L 時(shí),顯著性差異最大。同時(shí)，在處理濃度大于960mg/L后，部分?jǐn)?shù)值大大低于正常數(shù)值，因此，本實(shí)驗(yàn)選用960mg/L 濃度處理的種子進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定。

按照1.3 中所述方法對(duì)培養(yǎng)后的種子進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，種子中MDA 含量、CAT 活性、GR活性和POD 活性的測(cè)定結(jié)果，見圖8。

由圖8 可以看出，與清水培養(yǎng)后的種子相比，不同Zn2+濃度處理的種子MDA 含量、CAT和POD 活性都低于對(duì)照，GR 活性則遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照。

2.2 幼苗生長(zhǎng)對(duì)Zn2+的脅迫響應(yīng)

根據(jù)各處理下蓖麻種子萌發(fā)情況，選用Zn2+濃度為960mg/L 的ZnSO4溶液對(duì)蓖麻幼苗進(jìn)行培養(yǎng)，分別在7d、15d、21d 時(shí)對(duì)幼苗的整體、葉片及根部進(jìn)行觀察并分析。結(jié)果見圖9、圖10、圖11。圖A 為處理后的幼苗植株形態(tài)，圖B 為處理后的幼苗葉片形態(tài)，圖C 為處理后的幼苗根形態(tài)；CT 為實(shí)驗(yàn)組，CK 為對(duì)照。

可以發(fā)現(xiàn)，幼苗植株在培養(yǎng)7d 時(shí)與對(duì)照相差不大，隨著時(shí)間增加，植株越來(lái)越小；幼苗根長(zhǎng)在培養(yǎng)7d 時(shí)比對(duì)照長(zhǎng)約1/3，到15d 時(shí)根長(zhǎng)嚴(yán)重縮短，到21d 時(shí)，側(cè)生根明顯減少且主根呈現(xiàn)不健康的棕紅色；幼苗葉片在培養(yǎng)7d 時(shí)與對(duì)照無(wú)明顯差異，到15d 時(shí)葉片開始褪綠并出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，到21d 時(shí)，葉片嚴(yán)重褪綠，葉面大幅度縮小且黃色斑塊增多。但即使在該濃度下處理21d，幼苗仍未出現(xiàn)死亡，證明蓖麻對(duì)Zn2+具有很強(qiáng)的耐性。

根據(jù)1.3中所述方法對(duì)培養(yǎng)7d、15d、21d 后的幼苗分別進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，幼苗MDA 含量、CAT活性、GR 活性、POD 活性的測(cè)定結(jié)果，見圖12。

由圖12 可以看出，用Zn2+濃度為960mg/L的ZnSO4溶液處理的幼苗MDA 的含量與POD 活性低于對(duì)照很多，而CAT 與GR 活性則高出對(duì)照很多，其中用Zn2+濃度為960mg/L 的ZnSO4溶液處理的幼苗的POD 活性與對(duì)照相差最多。且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，沒有出現(xiàn)幼苗死亡現(xiàn)象，證明蓖麻對(duì)Zn2+的耐受程度極高。

3 討論

隨著鋅污染日益增加，大量含鋅污染物以塵、煙等形式排放到環(huán)境中，并最終通過(guò)土壤、水源、植物吸收和積累對(duì)人類健康造成威脅[19]。高效的處理鋅污染逐漸成為目前急需解決的問題。植物對(duì)重金屬的耐受程度與重金屬在其體內(nèi)的積累、轉(zhuǎn)運(yùn)等因素密切相關(guān)[20]。重金屬脅迫不但會(huì)影響植物中葉綠素的合成，還會(huì)影響植物體內(nèi)的正常代謝，最終導(dǎo)致植物體中各物質(zhì)含量的改變[18]。相關(guān)分析表明，Zn2+在植物體內(nèi)積累超出閾值，會(huì)對(duì)植物造成毒害，抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重可能造成植物死亡[21]。蓖麻根系發(fā)達(dá)，抗逆性較強(qiáng)，對(duì)Zn2+有很大的耐受性，可以通過(guò)吸收和代謝實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中鋅的吸附、凈化、固定[22]。Rosselli[23]等的研究表明，植物中Zn2+的轉(zhuǎn)運(yùn)能力較好，大部分向地上部分運(yùn)輸。抑制生長(zhǎng)和減少植株生物量是植物對(duì)Zn2+脅迫的普遍響應(yīng)[24，25]。本實(shí)驗(yàn)表明，蓖麻吸收小于960mg/L 濃度的Zn2+會(huì)促進(jìn)其生長(zhǎng)，而吸收超過(guò)960mg/L 濃度的Zn2+則會(huì)對(duì)蓖麻產(chǎn)生毒害，抑制其生長(zhǎng)，這與Rosselli的研究結(jié)果一致。與蓖麻相比，臭椿僅能適應(yīng)在Zn2+濃度不超1 000mg/L 的土壤中生存，法桐對(duì)Zn2+的耐受性更弱，不適合種在鋅污染土壤中[26]。而本實(shí)驗(yàn)中所用最高濃度Zn2+（2 280mg/L）處理的蓖麻仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，證明相比于其他植物，蓖麻對(duì)Zn2+耐受性更強(qiáng)。

4 結(jié)論

在種子萌發(fā)階段，隨著Zn2+濃度升高，蓖麻種子的發(fā)芽率雖然差異顯著，但無(wú)明顯趨勢(shì)，在Zn2+濃度達(dá)到960mg/L 時(shí)達(dá)到最大發(fā)芽率且顯著性差異最大；根長(zhǎng)與根粗顯示出先增后降，再增再降的趨勢(shì)；在生長(zhǎng)過(guò)程中即使Zn2+濃度達(dá)到2 280mg/L，種子仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，證明蓖麻對(duì)鋅有很高的耐受程度；在Zn2+濃度達(dá)到960mg/L 時(shí)，蓖麻種子中吸收了過(guò)量鋅，影響了其生長(zhǎng)。在幼苗生長(zhǎng)階段，用Zn2+濃度為960mg/L 的ZnSO4溶液處理幼苗，隨著處理時(shí)間的增加，幼苗植株越來(lái)越矮小，根長(zhǎng)縮短，葉片越來(lái)越小且褪綠越來(lái)越嚴(yán)重；生理指標(biāo)與對(duì)照相比證明在Zn2+濃度為960mg/L 的ZnSO4溶液培養(yǎng)下，蓖麻幼苗吸收的Zn2+逐漸增多，最終超過(guò)閾值，對(duì)蓖麻苗產(chǎn)生了嚴(yán)重傷害，影響其生長(zhǎng)。但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，處理后的種子和幼苗均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，證明蓖麻對(duì)Zn2+有極高的耐受性。