基于CRISPR-Cas9的擬南芥基因編輯后代鑒定技術(shù)的優(yōu)化

李子文，劉 言，呂夢(mèng)洋，高凱莉，張海榮

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

在抵抗外來(lái)病毒和噬菌體的漫長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)菌的基因組中出現(xiàn)了一系列成簇排列且與噬菌體基因組同源性極高的DNA序列，這些序列被稱為“規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列”(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)[1]。CRISPR最早被發(fā)現(xiàn)于1987年，但直到2005年才逐漸被人們所重視[2-3]。這些間隔序列被轉(zhuǎn)錄為crRNA(CRISPR RNA)并與自身的核酸酶Cas (CRISPR associated nuclease)形成復(fù)合體，當(dāng)外源噬菌體上的DNA與crRNA一致時(shí)，Cas蛋白就會(huì)對(duì)這段DNA進(jìn)行定點(diǎn)剪切，以破壞噬菌體DNA的復(fù)制達(dá)到防御的效果，CRISPR-Cas是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)由于Cas蛋白基因序列的不同被分為3類：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。不同于Ⅰ型和Ⅲ型需要多個(gè)Cas蛋白與crRNA形成crRNA復(fù)合體來(lái)剪切DNA雙鏈，Ⅱ型只需要Cas9蛋白對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行剪切，鑒于Ⅱ型的便捷性，現(xiàn)在應(yīng)用最多的是由Ⅱ型改造的CRISPR-Cas9核酸內(nèi)切酶[4-5]。以Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)為例，它的結(jié)構(gòu)主要包括5′端的tracrRNA(Trans-activating crRNA)基因、Cas9蛋白編碼基因和3′端由啟動(dòng)子區(qū)域、大量間隔序列和重復(fù)序列構(gòu)成的CRISPR序列。當(dāng)構(gòu)建好的CRISPR載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，CRISPR載體會(huì)在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄生成tracrRNA和crRNA，之后成熟的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白形成復(fù)合體，復(fù)合體將Cas9引導(dǎo)到靶DNA上，對(duì)這段DNA序列進(jìn)行剪切[1]。CRISPR靶向特異性由靶DNA和靶DNA 3′末端的短DNA序列(即PAM序列)決定。剪切后DNA雙鏈通過(guò)非同源末端連接或者同源重組的方式重新連接，大大提高突變概率，達(dá)到基因編輯的效果。現(xiàn)在常用的CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)將tracrRNA及crRNA設(shè)計(jì)為引導(dǎo)RNA (Small guide RNA,sgRNA)，這樣在sgRNA前面加上靶DNA的互補(bǔ)序列，利用靶DNA的互補(bǔ)序列將sgRNA-Cas9復(fù)合物引導(dǎo)到靶DNA上，實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)編輯。

CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)經(jīng)過(guò)不斷的改良，現(xiàn)已在小鼠、斑馬魚、擬南芥等多種模式物種上成功應(yīng)用[6-8]。在植物研究領(lǐng)域中，CRISPR-Cas9編輯技術(shù)已經(jīng)被證明可以對(duì)植物的單個(gè)或多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行定點(diǎn)編輯[9-10]，且這種編輯基因可以在植物后代中穩(wěn)定遺傳[11-12]。但是目前已報(bào)道的編輯植株的鑒定方法，通常是將靶DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果不好的認(rèn)定為可能有突變[10]，或者先用SURVEYOR試劑盒尋找靶DNA可能的突變后[11]，再將PCR產(chǎn)物連接克隆載體，挑取多個(gè)克隆分別進(jìn)行測(cè)序，過(guò)程煩瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究以擬南芥SDP1(Sugar-dependent 1)基因?yàn)榫庉媽?duì)象，選取SDP1外顯子上PAM序列附近有合適酶切位點(diǎn)的DNA序列作為基因編輯靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)后代株系的酶切鑒定和測(cè)序峰圖分析可以簡(jiǎn)單、便捷地鑒定穩(wěn)定遺傳的基因編輯植株后代，不用經(jīng)過(guò)連接克隆載體的步驟，而且一個(gè)后代植株只需要一次測(cè)序，為基因編輯植株后代的鑒定提供簡(jiǎn)單、快捷的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用的擬南芥野生型為Columbia的改良株系gl1。大腸桿菌菌株為DH5α，農(nóng)桿菌菌株為GV3101，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。擬南芥CRISPR-Cas9載體由朱健康課題組提供，含有sgRNA及Cas9。pCAMBIA1300為本實(shí)驗(yàn)保存。T4 DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶SacⅠ、KpnⅠ、Hind Ⅲ及非限制性內(nèi)切酶BbsⅠ均購(gòu)自NEB(北京)有限公司。

1.2 SDP1基因敲除靶位的篩選

為了在SDP1基因的外顯子上尋找PAM序列上游合適的酶切位點(diǎn)，用Snapgene分析SDP1三個(gè)外顯子上所有的酶切位點(diǎn)，排除受甲基化影響、具有星號(hào)活性、距離PAM序列較遠(yuǎn)的酶切位點(diǎn)，篩選合適的酶切位點(diǎn)。

1.3 SDP1的CRISPR-Cas9基因編輯表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)靶基因SDP1的sgRNA引物(表1)，引物兩端需要加上與CRISPR-Cas9載體BbsⅠ酶切后黏性末端互補(bǔ)的序列，以便2條引物復(fù)性后與CRISPR-Cas9載體BbsⅠ 酶切產(chǎn)物連接。將公司合成的SDP1-CIR-F及SDP1-CIR-R引物各1 nmol等量混合，通過(guò)95 ℃ 3 min、緩慢降溫到40 ℃使其復(fù)性形成DNA雙鏈，同時(shí)用BbsⅠ 內(nèi)切酶線性化CRISPR-Cas9載體，然后用T4連接酶連接CRISPR-Cas9線性化載體和SDP1-CIR復(fù)性引物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選得到CRISPR-SDP1-Cas9載體。將pCAMBIA1300載體和CRISPR-SDP1-Cas9載體同時(shí)用KpnⅠ和Hind Ⅲ酶切，用T4 DNA連接酶連接獲得pCAMBIA1300-SDP1-Cas9載體。

表1 靶基因SDP1的sgRNA引物序列 Tab.1 Primer sequence of sgRNA required for target gene SDP1

1.4 SDP1的CRISPR-Cas9基因編輯陽(yáng)性植株的篩選與鑒定

將構(gòu)建好的pCAMBIA1300-SDP1-Cas9載體質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，然后采用菌落PCR法篩選陽(yáng)性克隆。將正確的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)侵染野生型擬南芥gl1。待T0種子成熟后在含有潮霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，將正常生長(zhǎng)的T1植株進(jìn)行培養(yǎng)并取幼苗葉片提取DNA，PCR擴(kuò)增之后使用SacⅠ進(jìn)行酶切鑒定。選取酶切結(jié)果為3條帶的雜合植株進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序峰圖中在靶DNA位置出現(xiàn)雙峰表明出現(xiàn)基因編輯現(xiàn)象。對(duì)T2植株進(jìn)行DNA提取、酶切鑒定，選取酶切結(jié)果為1條帶的純合植株進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)合測(cè)序峰圖篩選定點(diǎn)突變純合植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDP1的CRISPR-Cas9基因編輯表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)SDP1基因外顯子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PAM序列上游有4個(gè)合適的酶切位點(diǎn)(圖1)。其中，SacⅠ內(nèi)切酶最常用，因此選取SDP1第二外顯子上含有SacⅠ酶切位點(diǎn)的序列作為基因敲除的靶位點(diǎn)，靶DNA序列為TGCAACCAGGTATTAGAGCT (圖2A)。

圖1 SDP1三個(gè)外顯子上的候選酶切位點(diǎn) Fig.1 Candidate restriction sites on the three exons of SDP1

將設(shè)計(jì)好的靶位點(diǎn)的引物復(fù)性，然后連接BbsⅠ內(nèi)切酶線性化的CRISPR-Cas9載體(圖2B)，然后將連接有SDP1靶DNA的CRISPR-Cas9(圖2C)用KpnⅠ和Hind Ⅲ酶切連接到pCAMBIA1300載體上，最終構(gòu)建了pCAMBIA1300-SDP1-Cas9基因編輯表達(dá)載體(圖2D)。

A:SDP1靶序列; B:CRISPR-Cas9載體的sgRNA中的Bbs Ⅰ位點(diǎn)序列; C:CRISPR-SDP1-Cas9載體與CRISPR-Cas9空載體序列比對(duì); D:pCAMBIA1300-SDP1-Cas9A:SDP1 target sequence；B:Bbs Ⅰ sequence in sgRNA sequence of CRISPR-Cas9 vector；C:Sequencing alignment between of CRISPR-SDP1-Cas9 vector and CRISPR-Cas9 vector；D:pCAMBIA1300-SDP1-Cas9圖2 SDP1的CRISPR-Cas9基因編輯表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of CRISPR-Cas9 gene editing expression vector for SDP1 gene

2.2 SDP1的CRISPR-Cas9基因編輯陽(yáng)性植株的鑒定及編輯檢測(cè)

隨機(jī)挑選經(jīng)潮霉素篩選后正常生長(zhǎng)的71株T1幼苗，提取葉片DNA，用SacⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。如圖3A所示，酶切結(jié)果呈現(xiàn)3條帶的為雜合編輯植株，2條帶的為無(wú)編輯發(fā)生的植株。在71株T1植株中有24株發(fā)生了雜合編輯，編輯效率為16.9%。隨后對(duì)在SDP1位點(diǎn)上發(fā)生編輯的雜合編輯植株提取DNA，進(jìn)行靶位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序，通過(guò)測(cè)序峰圖分析確定了發(fā)生基因編輯的位點(diǎn)(圖3B)。將編輯位點(diǎn)位于酶切位點(diǎn)上的雜合編輯植株繼續(xù)培養(yǎng)，挑選48株T2植株提取幼苗葉片DNA進(jìn)行酶切鑒定，酶切結(jié)果呈現(xiàn)1條較大條帶的為純合編輯植株 (圖3C)。在48株T2植株中有5株發(fā)生了純合編輯，編輯位點(diǎn)均在SacⅠ酶切位點(diǎn)上。將在SDP1位點(diǎn)上發(fā)生編輯的純合植株提取DNA，進(jìn)行靶位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，編輯發(fā)生在SacⅠ酶切位點(diǎn)上，插入了1個(gè)A或G(圖3D)。

A：T1植株酶切鑒定結(jié)果；B：T1雜合編輯植株正、反向測(cè)序分析；C：T2植株酶切鑒定結(jié)果；D：T2純合植株測(cè)序比對(duì)。黃色陰影部分為編輯發(fā)生位置，紅色字體為Sac Ⅰ酶切位點(diǎn)，藍(lán)色字體為插入堿基A:Restriction enzyme digestion result in T1 generation; B:Two-direction sequencing results of the heterozygous editing plants of T1 generation; C:Restriction enzyme digestion result in T2 generation; D:Sequencing comparison of T2 generation homozygous plant.The yellow shadow parts show edited position,the red letters are Sac Ⅰ restriction sites,and the blue ones are edited bases 圖3 SDP1的CRISPR-Cas9基因編輯陽(yáng)性植株的鑒定及編輯檢測(cè)Fig.3 Identification and editing detection of positive plants of SDP1 edited by CRISPR-Cas9 system

3 結(jié)論與討論

基因編輯是探究基因功能的重要技術(shù)之一，通過(guò)對(duì)目標(biāo)基因的定點(diǎn)敲除、添加或修飾來(lái)探究特定基因的功能。目前，常用的基因編輯技術(shù)主要有鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)[13-14]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)[15-16]和近些年逐漸興起的CRISPR-Cas系統(tǒng)。相對(duì)于制備煩瑣、成本高昂的ZFN和TALEN，構(gòu)建簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、編輯率更高的CRISPR-Cas系統(tǒng)受到了越來(lái)越多科學(xué)家的青睞[17]。

隨著CRISPR-Cas系統(tǒng)在人類細(xì)胞[18]、小鼠[19]、斑馬魚[20]等動(dòng)物細(xì)胞中的成功應(yīng)用，對(duì)水稻、小麥、玉米等植物基因的定點(diǎn)編輯也取得了許多成果[21-23]。但是目前已報(bào)道的編輯植株的鑒定方法十分煩瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。常用的基因編輯植物檢測(cè)方法是對(duì)靶DNA進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)雜峰的則可能有突變[10];或者用昂貴的SURVEYOR試劑盒，通過(guò)基因編輯的突變可形成不完全配對(duì)的DNA，進(jìn)而可以用酶切的方法尋找靶DNA可能的突變[11]，然后將可能有突變的PCR產(chǎn)物克隆到載體上，挑取多個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。這2種方法都要先找到可能的突變植株，然后將可能的突變植株靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，而且要進(jìn)行多次測(cè)序才能鑒定出其是否發(fā)生了基因編輯。

本研究在待編輯基因外顯子上選取臨近PAM序列的合適酶切位點(diǎn)作為引導(dǎo)序列靶點(diǎn)，利用酶切檢測(cè)從大量T1樣本中選出有3條DNA條帶的雜合編輯植株，同時(shí)結(jié)合正、反雙向測(cè)序(也可僅單向測(cè)序)，出現(xiàn)雜峰代表PCR產(chǎn)物中存在2個(gè)不同的DNA序列，篩選出CRISPR-Cas9后代中發(fā)生基因編輯的植株。對(duì)T1雜合植株的T2植株進(jìn)行酶切檢測(cè)，挑選出其中酶切結(jié)果為單一條帶的即為純合編輯植株，通過(guò)測(cè)序確定突變結(jié)果。另外，如果PAM序列上游找不到合適的酶切位點(diǎn)，直接將CRISPR-Cas9轉(zhuǎn)基因植株后代的靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，也是一個(gè)快捷有效的方法。本研究構(gòu)建了一種以酶切位點(diǎn)作為編輯靶點(diǎn)，適用于鑒定由CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯植株后代的鑒定方法，能夠更加省時(shí)省力地獲得純合且穩(wěn)定遺傳的基因編輯植株。