利用EMS誘變創(chuàng)制抗除草劑粳稻新種質(zhì)

王付華，李自超，王 亞，付 景，楊文博，尹海慶，王生軒，王越濤，白 濤，張 珍

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，北京 100193;3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)展覽館，河南 鄭州 450000)

水稻是我國(guó)主要糧食作物。當(dāng)前，農(nóng)業(yè)勞動(dòng)力價(jià)格飆漲，水稻種植方式輕簡(jiǎn)化趨勢(shì)明顯，水稻直播省工省力，推廣面積越來(lái)越大[1]。與傳統(tǒng)移栽相比，直播稻田雜草種子和水稻種子生長(zhǎng)同步，雜草生長(zhǎng)快、種類(lèi)多、密度大，容易滋生雜草稻[2]，雜草控制是制約水稻直播生產(chǎn)的關(guān)鍵。培育抗除草劑作物，便于大田雜草控制[3]。當(dāng)前，轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物已大面積生產(chǎn)應(yīng)用，主要有轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米、棉花、油菜和大豆等飼料、油料作物[4]，而轉(zhuǎn)基因水稻尚未在我國(guó)批準(zhǔn)商業(yè)使用。因此，培育非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻十分必要。國(guó)外非轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物已有成功先例，如20世紀(jì)末選育成功的抗三氮苯的油菜、抗咪唑啉酮的玉米等[5-6]。非轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物所抗除草劑主要包括咪唑啉酮類(lèi)、環(huán)己烯酮類(lèi)、磺酰脲類(lèi)、均三氮苯類(lèi)、有機(jī)磷類(lèi)和激素類(lèi)等[7]。乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,ALS)是亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等支鏈氨基酸合成中的關(guān)鍵酶，是多種除草劑的作用靶標(biāo)，包括咪唑啉酮類(lèi)(Imidazolinones， IMIs)、磺酰脲類(lèi)(Sulfonylureas，SUs)、嘧啶硫代苯甲酸脂類(lèi)(Pyrimidinylthio-benzoates，PTBs)、三唑并嘧啶類(lèi)(Triazolopyrimidines，TPs)和磺酰胺羰基三唑啉酮類(lèi)(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones，SCTs)[8-9]。ALS抑制劑類(lèi)除草劑與植物體內(nèi)的ALS結(jié)合形成復(fù)合物，阻斷底物進(jìn)入酶活性位點(diǎn)通路，抑制ALS活性，使支鏈氨基酸合成受阻，破壞植物細(xì)胞正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致植物死亡[10-12]。ALS基因某些位點(diǎn)的突變會(huì)減弱ALS與除草劑的結(jié)合力，產(chǎn)生除草劑抗性。對(duì)以ALS為靶標(biāo)的抗性雜草進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ALS的突變主要發(fā)生在8個(gè)氨基酸位點(diǎn)[12]；在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，ALS蛋白中有20多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替換會(huì)產(chǎn)生除草劑抗性[10-14]。

目前，水稻中已公開(kāi)報(bào)道了多個(gè)抗除草劑ALS氨基酸突變位點(diǎn)。1993年，路易斯安娜州立大學(xué)農(nóng)業(yè)中心通過(guò)EMS(甲基磺酸乙酯)誘變篩選到抗咪唑啉酮類(lèi)除草劑的水稻種質(zhì)AS3510，其ALS氨基酸突變?yōu)镚ly-628-Glu(第628位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?，利用AS3510選育出商業(yè)品種121CL、141CL[15]。利用EMS誘變豐產(chǎn)性品種Cypress，篩選到抗咪唑啉酮除草劑種質(zhì)PWC16，其ALS氨基酸突變?yōu)镾er-627-Asn，利用PWC16選育出商業(yè)品種CL161、141CL[16-17]，2002年美國(guó)的抗除草劑水稻實(shí)現(xiàn)商業(yè)生產(chǎn)，有效控制了當(dāng)?shù)仉s草稻的危害。阿根廷學(xué)者用EMS誘變當(dāng)?shù)厮酒贩NIRGA417也篩選到抗咪唑啉酮類(lèi)除草劑材料，選育出抗咪唑啉酮品種PUTA INTA CL，其ALS氨基酸突變?yōu)锳la-96-Thr[18]。OKUZAKI等[19]以雙草醚(嘧啶水楊酸類(lèi)除草劑)篩選水稻品種臺(tái)中65的花藥培養(yǎng)愈傷組織，獲得1個(gè)抗磺酰脲類(lèi)除草劑的突變體，ALS氨基酸突變?yōu)镚ly-95-Ala。近年來(lái)，我國(guó)多個(gè)研究單位篩選到ALS突變抗除草劑材料，深圳興旺生物種業(yè)有限公司用EMS誘變黃華占和黃絲占，以咪唑啉酮類(lèi)除草劑篩選，獲得3個(gè)抗性突變體(Tyr-548-Me/Cyst、Ala-96-Val/Thr、Ser-627-An)[20]。趙炳然等[21]以咪唑乙煙酸篩選EMS誘變的秈稻品種華航31，獲得4個(gè)抗性突變體，ALS氨基酸突變?yōu)锳la-179-Val、Ser-627-Asn、Gly-628-Glu、Val-643-Met。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用甲咪唑煙酸篩選經(jīng)EMS誘變的多個(gè)粳稻、秈稻品種，獲得多個(gè)抗除草劑突變體，ALS氨基酸突變包括Gly-136-Thr、Pro-171-His、Ala-179-Val、Ser-627-Asn、Gly-628-Glu等[22-25]。用除草劑篩選品種資源，王芳權(quán)等[26]從7 000多份水稻種質(zhì)資源中篩選到1份抗咪唑啉酮除草劑的材料，ALS氨基酸突變?yōu)镾er-627-Asn；畢俊國(guó)等[27]以咪唑乙煙酸篩選30 000份水稻種質(zhì)，同樣獲得1份ALS氨基酸突變?yōu)镾er-627-Asn的抗性材料。綜上可見(jiàn)，以往的抗除草劑水稻材料篩選以抗咪唑啉酮類(lèi)除草劑為主。煙嘧磺隆是磺酰脲類(lèi)除草劑，高效、低毒、便宜，能殺滅大田主要禾本科雜草和部分闊葉雜草，即“禾闊雙殺”，是玉米田前期主要除草劑，但水稻易受傷害。如果能通過(guò)誘變篩選到抗煙嘧磺隆的水稻新材料，創(chuàng)制抗除草劑新品種，對(duì)現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)意義重大，但目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，以自育直播粳稻品種鄭稻19為材料，采用EMS進(jìn)行誘變，然后用甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆篩選抗除草劑水稻新種質(zhì)，為選育非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻材料為粳稻品種鄭稻19(Zhengdao 19)，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育。EMS購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。甲咪唑煙酸銨鹽水劑(240 g/L)購(gòu)自登封市金博農(nóng)藥化工有限公司，三葉期雜草常規(guī)用量為300～450 mL/hm2。煙嘧磺隆可分散油懸浮劑(40 g/L)購(gòu)自江蘇長(zhǎng)青生物科技有限公司，三葉期雜草常規(guī)用量為750～1 500 mL/hm2。

1.2 EMS誘變處理

干種子EMS處理方法參照WU等[28]和TILL等[29]的方法稍有改動(dòng)。干種子于室溫浸種16 h，濾干水，分別用0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.6%EMS溶液(EMS溶液用0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH值7.2)于26 ℃恒溫?fù)u床(60 r/min)中浸泡8 h(每個(gè)劑量處理200粒種子)，然后在28 ℃發(fā)芽箱中催芽36～48 h，調(diào)查發(fā)芽率，確定半致死濃度，然后以該濃度對(duì)干種子進(jìn)行處理(同上)，在28 ℃發(fā)芽箱中催芽36～48 h，之后播種。采用常規(guī)濕潤(rùn)育秧，常規(guī)單本插植，M1成熟時(shí)每株收獲一穗，不脫粒，曬干。

1.3 抗除草劑突變體篩選

M2幼苗三葉期時(shí)，噴施112.5 g/hm2的24%甲咪唑煙酸篩選抗除草劑突變體，噴施60 g/hm2煙嘧磺隆篩選抗煙嘧磺隆突變體，處理14 d篩選抗除草劑的M2家系，篩選標(biāo)準(zhǔn)：相比絕大部分敏感株系能正常生長(zhǎng)，株高接近正常，葉色偏綠。2017、2018、2019年連續(xù)3 a用甲咪唑煙酸篩選M2家系，2017年篩選3 000份，2018、2019年各篩選30 000份M2家系；2019年以煙嘧磺隆篩選30 000份M2家系。

M2抗除草劑突變體家系加代時(shí)用除草劑篩選，篩選方法同上，選擇幼苗生長(zhǎng)正常無(wú)死苗的家系留種。

1.4 抗除草劑突變體ALS基因克隆和序列分析

根據(jù)NCBI網(wǎng)站日本晴(Nipponbare)ALS基因序列(Os02g30630)設(shè)計(jì)擴(kuò)增ALS基因全長(zhǎng)的引物ALS-F(5′-GACCCACCTGTCATCCTCATCC-3′)和ALS-R(5′-ACATACAAACATCATAGGCATACCACT-3′)。以M3抗除草劑突變體純合家系及鄭稻19基因組DNA為模板，采用TaKaRa PrimeSTAR?Max DNA Polymerase擴(kuò)增ALS基因。25 μL反應(yīng)體系：2×PrimeSTAR?MaxPremix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，基因組DNA 2.0 μL，補(bǔ)加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序： 98 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，68 ℃ 2.5 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃ 5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA片段大小符合預(yù)期時(shí)，剩余PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行克隆并測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，采用DNAStar-MegAlign軟件分析野生型和突變體ALS基因的DNA 序列差異，確定抗除草劑突變體的ALS基因突變位點(diǎn)。

1.5 突變體后代家系抗除草劑性能鑒定

用營(yíng)養(yǎng)缽(17 cm×10 cm×10 cm)裝過(guò)篩細(xì)土，將M3純合家系種子和鄭稻19種子播于土表，每缽播種子100粒，播后蓋細(xì)土，厚約1 cm，營(yíng)養(yǎng)缽放置于整理箱中(保持水深3 cm)，整理箱置于人工氣候室中，光強(qiáng)10 000 lx，光12 h/暗12 h，溫度25～28 ℃，相對(duì)濕度70%～85%。一葉期時(shí)間苗，每營(yíng)養(yǎng)缽留生長(zhǎng)一致的幼苗30株。三葉期時(shí)，分別噴施56.25、112.5、225、450、900 g/hm2甲咪唑煙酸，15、30、60、120、240 g/hm2的煙嘧磺隆，以噴水為對(duì)照；14 d后調(diào)查秧苗的生長(zhǎng)情況，稱(chēng)取6株秧苗鮮質(zhì)量，3次重復(fù)，計(jì)算各處理的鮮質(zhì)量減退率，計(jì)算公式為：鮮質(zhì)量減退率=(對(duì)照組每株鮮質(zhì)量-處理組每株鮮質(zhì)量)/對(duì)照組每株鮮質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄭稻19干種子EMS誘變劑量的確定

由表1可知，隨EMS用量增加，鄭稻19種子發(fā)芽率下降，0.8%、1.0%、1.2%EMS處理下發(fā)芽率分別為60.2%、51.3%、39.0%，1.0%為半致死劑量。因此，確定以1.0%EMS進(jìn)行誘變處理。

表1 鄭稻19干種子徑不同體積分?jǐn)?shù)EMS處理后的發(fā)芽率Tab.1 Germination rate of dry Zhengdao 19 seeds after treated by different concentrations of EMS %

2.2 水稻抗除草劑突變體的篩選

M2幼苗三葉期，噴施甲咪唑煙酸，噴施后14 d，敏感植株葉片黃化、生長(zhǎng)明顯受抑制；抗除草劑植株能正常生長(zhǎng)，株高明顯高于敏感植株，葉色偏綠(圖1A—F)。2017—2019年用甲咪唑煙酸共篩選63 000份M2家系，獲得抗除草劑突變體6份，其中2017年1份(HF1，圖1A)、2018年2份(HF2、HF3，圖1B、C)、2019年3份(HF4、HF5、HF6)(圖1D、E、F)。綜上，甲咪唑煙酸處理后，HF1 HF2、HF3、HF4、HF5和HF6生長(zhǎng)正常，說(shuō)明這些突變體具有良好的抗甲咪唑煙酸性。

2019年用煙嘧磺隆篩選M2家系30 000份，三葉期噴施煙嘧磺隆，噴施后14 d，敏感植株葉片枯黃、植株矮小，停止生長(zhǎng)，逐漸死亡；抗性植株生長(zhǎng)受抑制，再過(guò)7 d慢慢恢復(fù)正常生長(zhǎng)，共篩選獲得抗除草劑突變體2份(HF7和HF8)(圖1G、H)。綜上，煙嘧磺隆處理后，HF7和HF8表現(xiàn)受害癥狀，但能逐漸恢復(fù)正常生長(zhǎng)，說(shuō)明這些突變體具有抗煙嘧磺隆能力。

A—F： 抗甲咪唑煙酸突變體；G—H：抗煙嘧磺隆突變體。A:HF1; B:HF2; C:HF3;D:HF4; E:HF5; F:HF6; G:HF7; H:HF8A—F:Imazapic-risistant mutants; G—H:Nicosulfuron-risistant mutants.A:HF1; B:HF2; C:HF3;D:HF4; E:HF5; F:HF6; G:HF7; H:HF8圖1 水稻M2抗除草劑突變體篩選Fig.1 Screening of herbcide-resisitant rice mutants in M2

2.3 水稻抗除草劑突變體ALS基因序列分析

ALS是咪唑啉酮類(lèi)和磺酰脲類(lèi)除草劑的靶標(biāo)，為鑒定突變體ALS基因突變位點(diǎn)，對(duì)M3抗除草劑突變體和鄭稻19全長(zhǎng)ALS基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)抗除草劑突變體及鄭稻19的ALS基因ORF(Open reading frame)全長(zhǎng)均為1 935 bp，沒(méi)有內(nèi)含子，編碼644個(gè)氨基酸。比對(duì)抗除草劑突變體、鄭稻19和日本晴的ALS基因編碼序列(圖2)，發(fā)現(xiàn)鄭稻19 與日本晴ALS基因序列相同。HF2和HF5的ALS基因第1880位堿基由G突變?yōu)锳，使得ALS第627位氨基酸由絲氨酸突變成了天冬酰胺(Ser-627-Asn)；HF1、HF3、HF4和HF6的ALS基因第1883位堿基由G突變?yōu)锳，使得ALS第628位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?Gly-628-Glu)(圖2)。突變體ALS基因的堿基突變導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸突變，使得突變體獲得抗甲咪唑煙酸能力。HF7的ALS基因第511位堿基由C突變?yōu)門(mén)，使得ALS第171位氨基酸由脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸(Pro-171-Ser)；HF8的ALS基因第536位堿基由C突變?yōu)門(mén)，使得ALS第179位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸(Ala-179-Val)(圖2)。這2個(gè)位點(diǎn)的突變使HF7、HF8獲得抗煙嘧磺隆能力。

紅框?yàn)锳LS蛋白171位、179位和628位差異氨基酸，黃框?yàn)?27位差異氨基酸，下劃紅線(xiàn)、黃線(xiàn)分別為相應(yīng)的DNA差異堿基The red boxes indicate the mutated amino acids at sites 171,179 and 628 of the ALS protein,the yellow box indicates the mutated amino acids at site 627,and the underlined red or yellow lines indicate the corresponding discrepant DNA bases圖2 水稻抗除草劑突變體HF1—HF8與鄭稻19、日本晴ALS基因序列及編碼氨基酸序列比對(duì)(只顯示差異部分序列)Fig.2 Alignment of ALS gene sequence and encoded amino acid sequence of herbcide-resisitant rice mutants HF1—HF8,Zhengdao 19 and Nipponbare(only showing the discrepant sequence)

2.4 M2家系抗除草劑突變體出現(xiàn)頻率

3 a用甲咪唑煙酸篩選63 000份M2家系，獲得ALS氨基酸突變?yōu)镾er-627-Asn的材料2份、Gly-628-Glu的材料4份，突變頻率分別為0.003 2%、0.006 3%，相當(dāng)于獲得單堿基突變所致抗除草劑突變體分別需M2家系31 500、15 750份(表2)。用煙嘧磺隆篩選30 000份M2家系，獲得2份抗性突變體材料，單個(gè)堿基位點(diǎn)突變頻率為0.003 3%(表2)。特定位點(diǎn)抗除草劑突變頻率平均為0.004 0%，即篩選到ALS特定單堿基突變需M2家系23 250份(表2)，預(yù)示篩選30 000份M2家系能獲得所希望的抗除草劑單堿基突變。

2.5 抗咪唑啉酮類(lèi)和磺酰脲類(lèi)除草劑突變體的抗性鑒定

選擇純合HF1(Gly-628-Glu)、HF2(Ser-627-Asn)M3家系，三葉期分別噴施56.25、112.5、225、450、900 g/hm2甲咪唑煙酸和15、30、60、120、240 g/hm2煙嘧磺隆。14 d后，隨著噴施劑量增加，噴施甲咪唑煙酸處理的鄭稻19生長(zhǎng)明顯受抑制，生長(zhǎng)逐漸停止，緩慢死亡，鮮質(zhì)量減退率分別為36.91%、47.81%、47.87%、51.80%、58.71%。在1倍大田常規(guī)除草劑用量(112.5 g/hm2)下，突變體HF1、HF2鮮質(zhì)量減退率分別為13.09%、20.03%，顯著小于鄭稻19(P<0.05，圖3—4)；HF1、HF2在900 g/hm2劑量(8倍大田常規(guī)除草劑用量)下生長(zhǎng)仍正常，鄭稻19在4倍大田常規(guī)除草劑用量(450 g/hm2)下已死亡(圖3E)。說(shuō)明突變體具有強(qiáng)的甲咪唑煙酸抗性。

表2 M2家系A(chǔ)LS抗除草劑位點(diǎn)突變頻率Tab.2 Mutation frequency of herbicide-resistant sites of ALS in M2 lines

A—F：甲咪唑煙酸劑量分別為0、56.25、112.5、225、450、900 g/hm2A—F:Imazapic doses are 0， 56.25,112.5,225,450,900 g/ha respectively圖3 突變體HF1和HF2在不同劑量甲咪唑煙酸下的抗性鑒定Fig.3 Resistance identification of HF1 and HF2 mutants under different doses of imazapic

噴施煙嘧磺隆處理的鄭稻19生長(zhǎng)停滯，逐漸死亡，鮮質(zhì)量減退率分別為52.48%、54.77%、60.19%、60.20%、61.48%(圖5—6)。在30 g/hm2和60 g/hm2煙嘧磺隆下，突變體HF1、HF2鮮質(zhì)量減退率分別為24.81%、13.13%和34.13%、28.01%，顯著小于鄭稻19(P<0.05)，超過(guò)60 g/hm2突變體HF1、HF2鮮質(zhì)量減退率與鄭稻19差異變小，說(shuō)明突變體具有一定煙嘧磺隆抗性。HF2鮮質(zhì)量減退率始終低于HF1，說(shuō)明HF2突變體比HF1突變體有更強(qiáng)的煙嘧磺隆抗性。

圖4 突變體 HF1和HF2在不同劑量甲咪唑煙酸下的鮮質(zhì)量減退率Fig.4 The fresh weight reduction rate of HF1 and HF2mutants under different doses of imazapic

A—F:煙嘧磺隆劑量分別為0、15、30、60、120、240 g/hm2A—F:Nicosulfuron doses are 0，15,30,60,120,240 g/ha respectively圖5 突變體HF1和HF2在不同劑量煙嘧磺隆下的抗性鑒定Fig.5 Resistance identification of HF1 and HF2 mutants under different doses of nicosulfuron

圖6 突變體 HF1和HF2在不同劑量煙嘧磺隆下的鮮質(zhì)量減退率Fig.6 The fresh weight reduction rate of HF1 and HF2 mutants under different doses of nicosulfuron

3 結(jié)論與討論

3.1 抗除草劑突變體篩選

利用EMS誘變?nèi)后w篩選抗除草劑突變體，一般在M2—M4進(jìn)行[28-30]，早代選擇能減少加代次數(shù)，減輕工作量，M2是變異最大的世代，在M2進(jìn)行抗性篩選是有利的。從M1植株上收獲M2種子時(shí)可以選擇混收[31]，也可按家系收。本研究每個(gè)M2家系收1個(gè)單穗，2017年篩選3 000 M2家系，分株系(單穗)常規(guī)密度(8.6穗/m2)播種，占用秧田面積達(dá)350 m2，篩選到抗性突變體1份；2018、2019年單穗高密度種植(45穗/m2)，分別篩選30 000、60 000份M2家系，每30 000份材料播種面積控制在700 m2，極大地壓縮了篩選用秧田面積，2018、2019年分別篩選到抗性突變體2、5份，說(shuō)明高密度稻穗直接播種篩選苗期抗除草劑突變體可行，大幅減輕了工作量。另外，M2單穗分株系播種，抗除草劑突變體以家系整體出現(xiàn)，易于鑒別，也減輕了后期突變體鑒定工作量(混收混種時(shí)同一M2抗性突變體家系幼苗隨機(jī)分布大田，多個(gè)突變單株可能來(lái)自同一個(gè)M2株系，增加鑒別難度，也增加后期突變體抗性鑒定、基因克隆等工作)。

3.2 抗除草劑突變體的出現(xiàn)頻率

大劑量EMS處理，突變頻率高，容易獲得足量的點(diǎn)突變，廣泛用于構(gòu)建飽和突變體庫(kù)，如用于TILLING[28-30，32]。WU等[28]估計(jì)較大劑量(0.8%～1.0%)EMS誘變水稻，每個(gè)M2家系平均有100個(gè)以上的突變位點(diǎn)。TILL等[29]以1.5%EMS處理粳稻品種日本晴，發(fā)現(xiàn)每294 kb DNA片段有1個(gè)堿基突變。MARTN等[30]利用高劑量EMS處理獲得擬南芥突變體庫(kù)，通過(guò)TILLING檢測(cè)14個(gè)基因的突變事件，發(fā)現(xiàn)每個(gè)基因平均有16個(gè)錯(cuò)義突變，即每89 kb DNA片段有1個(gè)堿基突變。本研究中，以半致死劑量(1.0 %)EMS處理水稻干種子，用甲咪唑煙酸篩選63 000份M2家系，得到6份抗性突變體材料，包括2個(gè)突變位點(diǎn)，即Ser-627-Asn、Gly-628-Glu，突變頻率分別為0.003 2%、0.006 3%，相當(dāng)于獲得單堿基突變所致抗除草劑突變體分別需M2家系3 1500、15 750份。以煙嘧磺隆篩選30 000份M2家系，獲得2份抗性突變體材料(Pro-171-Ser、Ala-179-Val)，單個(gè)位點(diǎn)突變頻率為0.003 3%。特定位點(diǎn)抗除草劑突變頻率平均為0.004 0%，即篩選到ALS特定單堿基突變需M2家系23 250份。這為EMS誘變時(shí)M2群體規(guī)模的控制和篩選家系數(shù)量的確定提供了參考。

3.3 ALS基因突變及對(duì)除草劑的靶標(biāo)抗性

雜草對(duì)ALS抑制劑類(lèi)除草劑的抗性包括非靶標(biāo)抗性和靶標(biāo)抗性，靶標(biāo)抗性主要指由于靶標(biāo)酶基因突變，靶標(biāo)酶與除草劑結(jié)合受阻，或靶標(biāo)酶增強(qiáng)表達(dá)而產(chǎn)生抗性；非靶標(biāo)抗性是指通過(guò)減少除草劑的吸收傳導(dǎo)、提高除草劑的代謝及屏蔽隔離除草劑等方式產(chǎn)生抗性[14]。

ALS基因突變導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)序列關(guān)鍵位點(diǎn)出現(xiàn)氨基酸替換，改變酶與除草劑結(jié)合能力，除草劑除草能力降低或喪失[10-11]。對(duì)以ALS為靶標(biāo)的抗性雜草研究發(fā)現(xiàn)，ALS的突變主要發(fā)生在8個(gè)氨基酸位點(diǎn)：Ala-122、Pro-197、Ala-205、Asp-376、Arg-377、Trp-574、Ser-653和Gly-654[12]；在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，ALS蛋白中有20多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替換會(huì)產(chǎn)生除草劑抗性，不同位點(diǎn)突變所抗除草劑種類(lèi)有差異[13-14]。水稻中已公開(kāi)報(bào)道的ALS抗除草劑突變位點(diǎn)至少有Gly-95、Ala-96、Gly-136、Pro-171、Ala-179、Trp-548、Ser-627、Gly-628、Val-643等[15-27]。本研究通過(guò)用除草劑篩選EMS誘變的鄭稻19 M2家系，獲得8份抗除草劑突變體材料，包括4種突變類(lèi)型。Ser-627-Asn和Gly-628-Glu突變類(lèi)型材料主要抗咪唑啉酮類(lèi)[14]，本研究中HF1、HF2在噴施8倍大田常規(guī)除草劑劑量的甲咪唑煙酸(900 g/hm2)后仍能正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)強(qiáng)的除草劑抗性，是優(yōu)良抗除草劑材料，可作為抗性基因供體用于抗除草劑品種選育。研究報(bào)道，用咪唑啉酮類(lèi)除草劑篩選到的ALS基因突變抗性水稻系A(chǔ)S3510(Gly-628-Glu)，還對(duì)多種磺酰脲類(lèi)除草劑產(chǎn)生抗性[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)抗甲咪唑煙酸突變體HF1、HF2分別噴施1倍(30 g/hm2)、2倍(60 g/hm2)大田常規(guī)除草劑劑量的煙嘧磺隆，鮮質(zhì)量減退率顯著小于鄭稻19，說(shuō)明HF1、HF2兼具一定煙嘧磺隆抗性。本研究篩選的2個(gè)抗煙嘧磺隆突變體HF7(Pro-171-Ser)和HF8(Ala-179-Val)，在噴施60 g/hm2煙嘧磺隆后表現(xiàn)前期受抑制，但能緩慢恢復(fù)，說(shuō)明有一定抗性。這與前期報(bào)道的擬南芥中ALS氨基酸Ala-205(水稻Ala-179)、Pro-197(水稻Pro-171)位點(diǎn)突變產(chǎn)生磺酰脲類(lèi)除草劑抗性[14]一致。研究證明，在1個(gè)材料中使ALS基因2個(gè)或2個(gè)以上抗性位點(diǎn)同時(shí)突變，能增強(qiáng)除草劑抗性[34-35]，是創(chuàng)制強(qiáng)抗除草劑材料的有效途徑。設(shè)想未來(lái)利用獲得的抗性突變體進(jìn)行二次誘變，篩選多位點(diǎn)突變抗除草劑材料，以增強(qiáng)抗性，獲得能應(yīng)用于生產(chǎn)的抗煙嘧磺隆種質(zhì)；或通過(guò)基因編輯創(chuàng)制多位點(diǎn)突變的強(qiáng)抗煙嘧磺隆材料。