抗菌肽Fa-AMP基因的克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建

李 蒙，劉 璞，張芝星

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065)

抗菌肽(Antimicrobial Peptide)是一類具有抗菌活性的小分子多肽的總稱，是由宿主產(chǎn)生的能夠抵抗外界病原體感染，抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的殺傷作用，尤其是其對(duì)某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視[1]。廣泛存在于各種生物體內(nèi)，在微生物、植物和動(dòng)物體中均有發(fā)現(xiàn)并成功分離獲得。直接從生物體內(nèi)提取抗菌肽產(chǎn)量低、費(fèi)時(shí)長、工藝復(fù)雜[2-6]。因此，通過分子生物學(xué)技術(shù)合成人工抗菌肽是高效制備的理想選擇。

蕎麥(FagopyrumesculentumMoench.)是一種藥食兼用的經(jīng)濟(jì)作物，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，如防癌、降血糖、降血脂、抗衰老等多種生理功能。其中，蛋白質(zhì)作為蕎麥中重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌等不同生理活性[7]。Zhang等[8]將蕎麥抗菌肽編碼基因在原核系統(tǒng)重組表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物rBT對(duì)IM-9細(xì)胞系等具有生長抑制活性。趙紅倩等[9]通過Plackett-Burman和Box-hnken試驗(yàn)并聯(lián)優(yōu)化苦蕎蛋白酶解制備抗菌肽，發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用。并且發(fā)現(xiàn)其不但可以抑制肝癌細(xì)胞HepG2、肺癌WRL68、白血病L1210等細(xì)胞的生長，甚至可以抑制艾滋病病毒HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶活性[10]。因此，蕎麥抗菌肽是多功能活性肽，在抵抗微生物感染、提高機(jī)體免疫力等研究領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。

目前，已在多種植物中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽，F(xiàn)ujimura等[11]首次從甜蕎中分離得到了Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽，兩者在結(jié)構(gòu)中十分相似，僅在C端有一個(gè)氨基酸差異，具體的分子結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步闡明。本研究擬通過基因工程手段獲得蕎麥Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽的原核表達(dá)菌株，為高效制備具有生物活性蕎麥抗菌肽的開發(fā)利用提供重要的研究手段。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pET-47b(+)、大腸桿菌BL21(DE3)pLysS和DH5α均由西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

BamHⅠ、XhoⅠ核酸限制性內(nèi)切酶，DNA分子量Marker；pGM-T Vector載體；Taq PCR Mastermix；DNA純化試劑盒；質(zhì)粒提取試劑盒。

1.3 抗菌肽基因設(shè)計(jì)及引物合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中抗菌肽Fa-AMP1(accession P0DKH7.1)和Fa-AMP2(accession P0DKH8.1)蛋白質(zhì)序列分析，采用大腸桿菌中密碼子偏嗜性設(shè)計(jì)抗菌肽的核苷酸，F(xiàn)a-AMP1氨基酸序列(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQWGWCG STPKYCGAGCQSNCK)，F(xiàn)a-AMP2氨基酸序列(AQCGAQGGGATCPGG LCCSQWGWCGSTPKYCGAGCQSNCR)，F(xiàn)a-AMP1核苷酸序列(5′-GCTC AATGTGGTGCTCAAGGTGGTGGTGCTACCTGTCCTGGTGGT TTGTGTTGTTCTCAATGGGGTTGGTGTGGTTCTACCC CAAAGTACTGTGGTGCTGGTTGTCAATCTAACTGTAA A-3′)；Fa-AMP2核苷酸序列(5′-GCTCAATGTGGT GCTCAAGGTGGTG GTGCTACCTGTCCTGGTGGTTTGTGTTGTTCTCAATGGGGTTGGTGTGGTTCTACCCCA AAGTACTGTGGTGCTGGTTGTCAATCTAACTGTAGA-3′)。

1.4 抗菌肽基因的合成和原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)Fa-AMP1和Fa-AMP2優(yōu)化后的核苷酸序列，設(shè)計(jì)具有互補(bǔ)重疊區(qū)的引物，利用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)的5條互補(bǔ)引物(表1)，分別為Fa1、Fa2、Fa3、Fa4、Fa5引物，采用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法，多步PCR獲得目的基因。

Fa-AMP1抗菌肽基因獲得的PCR反應(yīng)體系(25 μL)：Fa1、Fa2、Fa3、Fa4這4種引物各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(each10 mmol/L)0.5 μL，Pfu DNA酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。Fa-AMP2抗菌肽基因獲得的反應(yīng)體系(25 μL)：Fa1、Fa2、Fa3、Fa5這4種引物各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(each10 mmol/L)0.5 μL，Pfu DNA酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。

PCR程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA電泳分析，產(chǎn)物置于-20 ℃保存。經(jīng)Tap酶擴(kuò)增連接到pGM-T Vector載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α,陽性克隆經(jīng)PCR和測序(上海生物工程公司)鑒定。

表1 合成Fa-AMP基因的引物

Fa-AMP1和Fa-AMP2經(jīng)測序鑒定正確后，重新設(shè)計(jì)帶有BamHⅠ和XhoⅠ核酸限制性內(nèi)切酶的上下游引物，F(xiàn)a-AMP1和Fa-AMP2的上游引物(5′-ACTCGGGATCCGGCTCAATGTGGTGCTCAAGGTGGTG-3′，下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，F(xiàn)a-AMP1的下游引物(5′-ACACCGCTCGAGTTTACAGTTAGATTGACAACCA GC-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，F(xiàn)a-AMP2的下游引物(5′-ACACCGCTCGAGTCTACAGTTAGATTGACAACCAGC-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))；以測序正確的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s(Fa-AMP1為65 ℃，F(xiàn)a-AMP2為64 ℃)，72 ℃延伸20 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min。使用核酸限制性內(nèi)切酶對(duì)純化的PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-47b(+)進(jìn)行雙酶切，酶切后構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，對(duì)再次重組的表達(dá)載體進(jìn)行測序。

1.5 序列比對(duì)與分析

利用ExPASy在線進(jìn)行氨基酸序列分析(https://web.expasy.org/translate/)，等電點(diǎn)及分子量預(yù)測(https://web.expasy.org/protparam/)；在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；空間結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的鑒定

Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽基因的多步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA電泳分析，由圖1和圖2可知，100～250 bp間有特異性條帶，符合預(yù)期結(jié)果，連接到pGM-T Vector載體測序結(jié)果也表明與實(shí)驗(yàn)前期設(shè)計(jì)的Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽基因一致，在線軟件預(yù)測Fa-AMP1和Fa-AMP2的重組蛋白分子量分別為6.49和6.52 kDa，等電點(diǎn)為6.97。

M:DL2000；1～4：Fa-AMP1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖1 Fa-AMP1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 基因與載體的酶切

使用核酸限制性內(nèi)切酶對(duì)純化的Fa-AMP1和Fa-AMP2基因和原核表達(dá)載體pET-47b進(jìn)行雙酶切及檢測(圖3和圖4)，酶切成功后進(jìn)行連接。

2.3 構(gòu)建重組表達(dá)載體

連接轉(zhuǎn)化后，構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET-47b+Fa-AMP1和pET-47b+Fa-AMP2進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示(圖5)，100～250 bp間有特異性條帶，符合預(yù)期結(jié)果，重組表達(dá)載體測序結(jié)果顯示構(gòu)建成功。

M:DL2000；1:pET-47b的雙酶切結(jié)果。圖4 質(zhì)粒pET-47b的雙酶切結(jié)果

M:DL2000；1：Fa-AMP1重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果；2：Fa-AMP2重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果；3：pET-47b+Fa-AMP1重組質(zhì)粒； 4：pET-47b+Fa-AMP2重組質(zhì)粒。

2.4 生物信息學(xué)分析

獲得基因通過NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，結(jié)果顯示氨基酸序列一致，通過SOPMA對(duì)Fa-AMP1和Fa-AMP2進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋所占比例為5%和2.5%，β折疊所占比例為15%，無規(guī)則卷曲所占比例為80%和82.5%，說明其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊和無規(guī)則卷曲為主。利用在線ExpASy的SWISS-MODEL對(duì)其進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示是多肽的無規(guī)則卷曲(圖6)。

圖6 抗菌肽Fa-AMP的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

抗菌肽是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，由特定基因編碼，具有廣譜抗菌活性，除了具有抗細(xì)菌作用外，還具有抗真菌、抗腫瘤活性、抗病毒、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等功效[12]，它是具有生物學(xué)活性的多個(gè)氨基酸組成的多肽[13]，深入研究蕎麥小分子活性肽，對(duì)于蕎麥蛋白資源的開發(fā)利用具有重要的意義。

植物抗菌肽在一級(jí)結(jié)構(gòu)方面相當(dāng)保守序列，即分子內(nèi)都含豐富的分子內(nèi)二硫橋，二硫橋是體外合成多肽技術(shù)面臨的重要難題[14]。人工合成雖可獲得與天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正確的空間結(jié)構(gòu)，且成本昂貴，使其僅停留在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)階段，同樣，體外分離天然抗菌肽或抗菌蛋白也是費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，本次實(shí)驗(yàn)通過基因工程的方法成功構(gòu)建蕎麥抗菌肽的原核表達(dá)載體pET-47b+Fa-AMP1和pET-47b+Fa-AMP2，下一步進(jìn)行體外表達(dá)是短時(shí)間得到大量抗菌肽產(chǎn)物的好方法；為獲得具有生物活性的抗菌肽，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，選擇合適的融合蛋白標(biāo)簽進(jìn)行體外表達(dá)，是短時(shí)間獲得具有生物活性且規(guī)?；a(chǎn)制備抗菌肽的理想選擇。