指狀青霉草酰乙酸水解酶的結(jié)構(gòu)特征與原核表達(dá)分析

胡紫微,李至敏,張夢(mèng)潔,徐依婷,李志敏**

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,江西 南昌330045;2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,江西 南昌330045)

指狀青霉(Penicilliumdigitatum)導(dǎo)致柑橘果實(shí)采后腐爛形成的綠霉病是柑橘類果實(shí)在儲(chǔ)存運(yùn)輸期間發(fā)生的最嚴(yán)重病害之一[1]。目前一般多用化學(xué)殺菌劑抑制指狀青霉的生長(zhǎng)來(lái)防治綠霉病,比如咪鮮胺(撲霉靈)、抑霉唑、噻苯唑、鄰苯基苯酚鈉等物質(zhì)[2,3]。然而化學(xué)殺菌劑在柑橘果實(shí)的殘留對(duì)人體的潛在風(fēng)險(xiǎn),病原菌對(duì)化學(xué)殺菌劑的耐藥性以及化學(xué)殺菌劑引發(fā)的食品安全、環(huán)境污染等問(wèn)題,使得人們開(kāi)始采用生物防治方法來(lái)控制柑橘果實(shí)采后病害[4]。生物防治策略主要包括微生物保鮮劑、植物源提取物、天然化合物、食品添加劑、公認(rèn)安全的化合物等方面及其聯(lián)合使用的策略[5]。然而這些策略方法并沒(méi)有取得較好的防治綠霉病效果。

隨著2012年指狀青霉全基因組序列的公布[6],從分子水平解釋指狀青霉致病機(jī)理的研究越來(lái)越多。多個(gè)研究表明,在指狀青霉致病過(guò)程中,果膠裂合酶基因(Pnl1)[7]、pH信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子基因(PdpacC)[8]、分裂素激活蛋白激酶基因(PdMpkB)[9]等都發(fā)揮了關(guān)鍵作用。此外,人們發(fā)現(xiàn)真菌的致病性與其生長(zhǎng)過(guò)程中草酸的分泌相關(guān)[10-11]。包括食品生物技術(shù)真菌黑曲霉(Aspergillusniger)、植物病原真菌灰霉菌(Botrytiscinerea)與核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、人類條件致病菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和許多褐腐擔(dān)子菌、白腐擔(dān)子菌在內(nèi)的絲狀真菌可以產(chǎn)生大量草酸[12]。毒力機(jī)制研究認(rèn)為酸化觸發(fā)了木質(zhì)纖維素的降解,降低了寄主組織的活力,有利于病原體的增殖,同時(shí)草酸的合成可以誘導(dǎo)草酸鈣結(jié)晶的形成,從而阻塞血管或?qū)Ч躘10,13]。真菌產(chǎn)生草酸主要有3種潛在途徑:乙醛酸的氧化、羥基乙醛的氧化和草酰乙酸的水解[14]。

草酰乙酸水解酶(Oxaloacetate hydrolase,OAH,EC 3.7.1.1)催化草酰乙酸水解形成乙酸和草酸,是草酰乙酸水解生成草酸的關(guān)鍵酶(圖1)[15-16]。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)將編碼OAH的基因敲除失活后,灰霉菌合成草酸的能力基本喪失[14]。轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)指狀青霉在侵染柑橘果實(shí)的過(guò)程中Oah基因轉(zhuǎn)錄水平大幅提高[7],由此可見(jiàn)指狀青霉草酰乙酸水解酶(PdOAH)可能是該菌侵染柑橘果實(shí)的關(guān)鍵因子。由于PdOAH是指狀青霉中一個(gè)可能的致病因子,針對(duì)PdOAH的抑制劑研究將會(huì)為指狀青霉的防治提供新思路。PdOAH的結(jié)構(gòu)特征信息有助于抑制劑的理性設(shè)計(jì),原核表達(dá)純化的重組蛋白將為PdOAH的生化特征和催化機(jī)理研究提供重要的基礎(chǔ)材料。

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)PdOAH的生物信息學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)研究,探索了其催化中心的關(guān)鍵氨基酸殘基。然后人工合成了編碼PdOAH的基因并將其構(gòu)建到pET-21a載體,在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了重組PdOAH的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化,研究了溫度和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)的影響。

圖1 OAH催化草酰乙酸水解形成草酸和乙酸

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保藏。pET21a-OAH重組質(zhì)粒由上海祥音生物科技有限公司合成。PageRuler預(yù)染蛋白Ladder購(gòu)自ThermoFisher Scientific公司。0.22 μm過(guò)濾器購(gòu)于Millipore公司。鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)瓊脂糖凝膠樹(shù)脂購(gòu)于QIAGEN公司。胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)于OXOID公司。質(zhì)粒測(cè)序由上海祥音生物科技有限公司完成。其它主要試劑均為分析純,購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 指狀青霉草酰乙酸水解酶(PdOAH)的生物信息學(xué)分析

利用ExPAsy-ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行等電點(diǎn)、蛋白分子量、穩(wěn)定性等預(yù)測(cè)。在NCBI中找到指狀青霉來(lái)源的草酰乙酸水解酶基因序列,同時(shí)進(jìn)行BLAST序列分析。利用在線軟件ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)分析蛋白氨基酸結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用 PyMOL軟件對(duì)蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬展示。

1.3 溫度對(duì)重組PdOAH表達(dá)的影響

挑取pET21a-OAHBL21(DE3)單克隆菌落，將其接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。次日,按1%接種量轉(zhuǎn)接于100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)一定時(shí)間。當(dāng)OD600 nm值為0.6左右時(shí),于冰水浴中冷卻30 min,加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.2 mmol/L),分別置于16、25、30、37 ℃,180 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h。在第3天,將菌液以4000 r/min離心15 min，然后收集菌體。用體積質(zhì)量比為20∶1的20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液重懸菌體,并進(jìn)行超聲破碎(超聲條件:變幅桿10 mm,工作時(shí)間2 s,間隔時(shí)間8 s,功率10%,工作總時(shí)間2 min)；將細(xì)胞破碎液于4 ℃、12000 r/min離心30 min，得到上清和沉淀；加入4×蛋白上樣緩沖液，混合均勻后在100 ℃下加熱處理5 min；最后用12.5% (v/v)的SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。加樣體積均為10 μL。

1.4 IPTG濃度對(duì)PdOAH表達(dá)的影響

挑取pET21a-OAHBL21(DE3)單克隆菌落，將其接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。次日,按1%接種量轉(zhuǎn)接于100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)一定時(shí)間。當(dāng)OD600 nm值約為0.6時(shí),于冰水浴中冷卻30 min,然后分別加入不同濃度(0、0.01、0.05、0.20和1.00 mmol/L)的IPTG,并置于16 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h。在第3天,將菌液以4000 r/min離心15 min，收集菌體。用20倍體積的20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液重懸菌體,并進(jìn)行超聲破碎(超聲條件:變幅桿10 mm,工作時(shí)間2 s,間隔時(shí)間8 s,功率10%,工作總時(shí)間2 min)；將細(xì)胞破碎液于4 ℃下以12000 r/min離心30 min，得到上清和沉淀；加入4×蛋白上樣緩沖液，混合均勻后于100 ℃加熱處理5 min；最后用12.5% (v/v)的SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。加樣體積均為10 μL。

1.5 重組PdOAH的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取pET21a-OAHBL21(DE3)單克隆菌落，將其接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中,于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。次日,按1%接種量轉(zhuǎn)接于400 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的Amp)中擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)OD600 nm值為0.6左右時(shí),于冰水浴中冷卻30 min；然后加入IPTG(終濃度為0.2 mmol/L),置于16 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h。第3天,將菌液以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，收集菌體，以備后續(xù)分離純化使用。

1.6 重組PdOAH的分離純化

將誘導(dǎo)表達(dá)得到的pET21a-OAHBL21(DE3)菌體用20倍體積(g/mL)的binding buffer(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0緩沖液)重懸,用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將菌液進(jìn)行超聲破碎,將細(xì)胞破碎液置于4 ℃、12000 r/min冷凍高速離心機(jī)中離心1 h，將獲得的上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，然后上樣于10 mL Ni-NTA樹(shù)脂[事先用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液平衡];隨后用20～200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液(含20～200 mmol/L咪唑、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)進(jìn)行濃度梯度洗脫,分別收集不同咪唑濃度下的蛋白洗脫液。加入4×蛋白上樣緩沖液，混合均勻后在100 ℃下處理5 min，獲得樣品,最后用12.5% (v/v)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)蛋白掛柱情況,分析雜蛋白和目的蛋白的分離情況,確定最佳的洗脫咪唑濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdOAH的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PdOAH基因的核苷酸大小為1005 bp,可編碼334個(gè)氨基酸。PdOAH蛋白的理論分子量大小是36.53521 kDa,等電點(diǎn)(pI)為6.01,親水性和不穩(wěn)定性指數(shù)分別為-0.074和26.06,表明PdOAH為親水性蛋白且是穩(wěn)定的。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),PdOAH屬于異檸檬酸裂解酶/磷酸烯醇丙酮酸變位酶超家族成員(ICL/PEPM superfamily),具有Mg2+/Mn2+結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。PdOAH與來(lái)源于其它3種真菌的OAH氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明PdOAH與黑曲霉、灰霉菌及板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)來(lái)源的OAH氨基酸序列同源性分別為83.59%、73.66%及72.66%。PdOAH蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖4B所示。該蛋白含有11個(gè)α-螺旋、6個(gè)β-折疊以及多個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，其中α-螺旋占比高達(dá)44.6%,含有149個(gè)氨基酸;β-折疊占比較低，為11.07%,含有37個(gè)氨基酸。

圖2 PdOAH氨基酸序列的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2 PdOAH的建模結(jié)構(gòu)分析

Chen等[17]于2010年解析出板栗疫病菌OAH的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:3m0k)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)PdOAH與板栗疫病菌OAH的氨基酸序列同源性高達(dá)72.66%(圖3),因此選擇板栗疫病菌OAH蛋白作為模板(PDB ID:3m0k),應(yīng)用SWISS-MODEL在線工具對(duì)PdOAH進(jìn)行同源建模,建模結(jié)果如圖4所示。PdOAH蛋白的整體結(jié)構(gòu)類似于ICL/PEPM超家族的其它成員[18],均由二聚體結(jié)合二聚體形成了同源四聚體(圖4A)。PdOAH蛋白與ICL/PEPM超家族其它成員一樣,催化活性中心位于結(jié)構(gòu)的中心。催化中心的氨基酸殘基大部分都位于α-螺旋和β-折疊的末端,這與前期預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果是一致的。PdOAH蛋白催化中心的結(jié)構(gòu)示意圖如圖5所示。在催化中心中可能與產(chǎn)物草酸有氫鍵作用的氨基酸殘基有Tyr69、Ala73、Thr71、Gly72、Asp113、Arg187、Asn240和Ser266(圖5)。

QBN20786.1、BAM16481.1、AAS99938.1和ADF28676.1分別代表來(lái)源于指狀青霉、黑曲霉、灰霉病、板栗疫病菌的OAH。三角形所示為參與酶催化的氨基酸殘基。

A:PdOAH蛋白四聚體結(jié)構(gòu);B:PdOAH蛋白單體結(jié)構(gòu)。關(guān)鍵氨基酸殘基(綠色為碳原子，深藍(lán)色為氮原子)和產(chǎn)物草酸(碳原子為淡藍(lán)色，氧原子為紅色)為棍棒結(jié)構(gòu),金屬離子(Mn2+)為紫色球形。α-螺旋、β-折疊及無(wú)規(guī)則卷曲分別為紅色、黃色和綠色。黑色虛線為催化中心的氫鍵。

2.3 溫度對(duì)重組PdOAH原核表達(dá)的影響

固定誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為0.2 mmol/L,將pET21a-OAHBL21(DE3)表達(dá)菌株分別置于16、25、30、37 ℃,180 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h后,重組PdOAH蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況如圖6所示。泳道1、4、7、10分別對(duì)應(yīng)上述4個(gè)溫度誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞破碎液(圖6),由此可知PdOAH蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)量很高,但隨著溫度的升高表達(dá)量逐漸減少，由此表明pET21a-OAHBL21(DE3)菌株在上述4個(gè)溫度下都能大量表達(dá)目的蛋白,而在16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白含量最高。泳道2、5、8、11對(duì)應(yīng)上述溫度下表達(dá)細(xì)胞破碎離心后的上清液,在16 ℃條件下上清液中PdOAH含量最多(圖6)。由此可見(jiàn)溫度對(duì)重組PdOAH蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)具有明顯的影響。因此,后續(xù)將用16 ℃、180 r/min條件對(duì)pET21a-OAHBL21(DE3)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

OXL指草酸(碳原子為淡藍(lán)色)；關(guān)鍵氨基酸殘基(碳原子為綠色)旁的數(shù)字為其在PdOAH蛋白質(zhì)氨基酸序列中的位置。黑色虛線為催化中心的氫鍵。

M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);泳道1～3號(hào)分別為16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的全菌、上清、沉淀;泳道4～6號(hào)分別為25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的全菌、上清、沉淀;泳道7～9號(hào)分別為30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的全菌、上清、沉淀;泳道10～12號(hào)分別為37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的全菌、上清、沉淀。

2.4 誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)重組PdOAH原核表達(dá)的影響

固定溫度為16 ℃,將pET21a-OAHBL21(DE3)表達(dá)菌株分別加入終濃度為0、0.01、0.05、0.20和1.00 mmol/L的IPTG后誘導(dǎo)表達(dá)24 h,重組PdOAH蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況如圖7所示。泳道1、3、5、7、9分別對(duì)應(yīng)上述5個(gè)IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞破碎液,由圖7可知PdOAH蛋白在未加入IPTG誘導(dǎo)劑時(shí)基本不表達(dá),0.01、0.05、0.20、1.00 mmol/L的IPTG對(duì)PdOAH蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)量相當(dāng)。泳道2、4、6、8、10對(duì)應(yīng)上述5個(gè)IPTG濃度下表達(dá)細(xì)胞破碎離心后的上清液,結(jié)果表明IPTG濃度對(duì)其可溶性表達(dá)幾乎沒(méi)有影響(圖7)。因此,后續(xù)將用0.20 mmol/L IPTG對(duì)pET21a-OAHBL21(DE3)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);泳道1～2號(hào)分別為0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的全菌和上清;泳道3～4號(hào)分別為0.01 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的全菌和上清;泳道5～6號(hào)分別為0.05 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的全菌和上清;泳道7～8號(hào)分別為0.20 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的全菌和上清;泳道9～10號(hào)分別為1.00 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的全菌和上清。

2.5 重組PdOAH蛋白的分離純化

利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和層析技術(shù)分離純化重組PdOAH蛋白。與表達(dá)的其它雜蛋白相比,目的PdOAH蛋白含有多聚組氨酸(6×His)標(biāo)簽，從而與Ni2+結(jié)合更緊密,因此雜蛋白和目的蛋白在不同濃度的咪唑洗脫液中可以分別被洗脫出來(lái)(圖8)。流穿液(FT)中含有大量的雜蛋白,表明雜蛋白因不含6×His標(biāo)簽而不與Ni2+結(jié)合。然而,泳道FT同樣顯示約50%的目的PdOAH蛋白未與Ni2+緊密結(jié)合?？赡艿脑蚴侵亟MPdOAH蛋白由于部分溶解、折疊不正確或與其它分子結(jié)合而引起表面結(jié)構(gòu)的變化[19],導(dǎo)致6×His標(biāo)簽未完全暴露,造成PdOAH蛋白與Ni2+的親和力降低,使得部分PdOAH蛋白未能掛柱。在200 mmol/L咪唑濃度下成功洗脫出大量目的PdOAH蛋白。收集純度較高(圖8中泳道7～11)的蛋白進(jìn)行濃縮脫鹽處理,以備后續(xù)酶活力測(cè)定使用。

M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);WC:全菌;S:上清液;FT:流穿液;1～4號(hào)分別為20、40、60、80 mmol/L咪唑洗脫液;5～11號(hào)均為200 mmol/L咪唑洗脫液。

3 討論與結(jié)論

病原菌利用體內(nèi)生物合成的草酸侵染和破壞植物組織,因此草酸的生物合成可能是病原菌致病的關(guān)鍵因素。真菌生物合成草酸的一個(gè)重要途徑是OAH催化草酰乙酸水解。在對(duì)核盤菌草酸生物合成途徑的研究中,人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)OAH基因缺失時(shí),核盤菌體內(nèi)和菌核中草酸的積累會(huì)消除,而將OAH基因重新導(dǎo)入缺失株后,草酸的積累又恢復(fù)到野生型的水平[20]。在對(duì)黑曲霉[14]、板栗疫病菌[18]、產(chǎn)黃青霉菌[21]的研究中,也存在類似的現(xiàn)象,從而進(jìn)一步證明真菌中草酰乙酸的水解是形成草酸的一條重要途徑,對(duì)草酸的生物合成具有重要貢獻(xiàn)。因此,為了研究指狀青霉中草酸的合成途徑,后續(xù)需要對(duì)OAH基因進(jìn)行敲除,從而確定指狀青霉中草酸生成的基本途徑,這對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病的防治有重大意義。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PdOAH蛋白屬于異檸檬酸裂解酶/磷酸烯醇丙酮酸變位酶超家族。該家族蛋白催化含有C-C鍵或者P-C鍵底物的裂解,因而該家族又分為“C-C鍵裂解酶”和“P-C鍵裂解/形成酶”兩大分支[17]。C-C鍵裂解酶分支主要成員有異檸檬酸裂合酶、2-甲基異檸檬酸裂合酶、草酰乙酸水解酶和花瓣死亡蛋白酶等,催化各種羥基酸底物C-C鍵的裂解,形成α-羥基羧酸[22-24]。P-C鍵裂解酶分支成員包括磷酸烯醇丙酮酸突變酶、磷酸基丙酮酸水解酶和羧基PEP突變酶等,催化α-酮羧酸底物中的磷酸鍵裂解形成烯酸中間體[25-27]。PdOAH蛋白屬于C-C鍵裂解酶分支。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示PdOAH蛋白與其它來(lái)源的OAH蛋白具有高度的同源性,并且催化活性中心的大部分氨基酸殘基高度保守,這為后續(xù)研究PdOAH的催化機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的PdOAH蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與同源建模獲得的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有較高的一致性,說(shuō)明該預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)和建模結(jié)構(gòu)質(zhì)量較高。

本研究探索了不同溫度和IPTG濃度對(duì)重組PdOAH原核表達(dá)量及可溶性的影響,確定了誘導(dǎo)表達(dá)的最適溫度和最適IPTG濃度。在16 ℃條件下,重組PdOAH蛋白的表達(dá)量最高;當(dāng)IPTG濃度大于0.2 mmol/L時(shí),重組PdOAH蛋白可溶性最佳。Ni-NTA親和層析純化結(jié)果表明,在200 mmol/L咪唑洗脫液下可以獲得純度較高的重組PdOAH蛋白。本研究結(jié)果為今后進(jìn)一步探索PdOAH蛋白的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)和催化機(jī)理，以及開(kāi)發(fā)草酰乙酸水解酶抑制劑奠定了基礎(chǔ)，也將為柑橘果實(shí)綠霉病的防治提供科學(xué)依據(jù)。