鋁處理對不同耐鋁水稻品種吸收銨態(tài)氮和硝態(tài)氮以及相關基因表達的影響

劉增泰,趙學強*,王嘉林,沈仁芳

(1.土壤與農業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室/中國科學院 南京土壤研究所,江蘇 南京 210008;2.中國科學院大學,北京 100049)

水稻是世界五大糧食作物之一,約有13%的水稻種植于酸性土壤[1-2]。在酸性土壤上植物的生產力主要受到鋁毒的限制,在pH值低于5.0時受限尤為嚴重[3-4]。水稻生長的最佳pH范圍是5.0～5.8,當土壤pH值低于5.0時,鋁毒會顯著抑制水稻的生長。氮是植物需求最多的礦質營養(yǎng)元素,酸性土壤氮素缺乏也是限制植物生長的主要因素[5]。因為鋁對植物的毒害主要表現(xiàn)為快速抑制根的伸長[6],而根系是植物吸收養(yǎng)分的主要器官,所以鋁毒可能會影響植物對氮素的吸收。一方面,鋁對根生長的抑制作用將導致根系吸收面積變小和生長狀態(tài)變差,從而減少根系對氮素等營養(yǎng)物質的吸收;另一方面,鋁可能直接影響植物體內氮素等營養(yǎng)物質的運輸和代謝,從而影響對土壤氮素的吸收[7]。

迄今已有一些關于不同氮源對植物鋁毒影響的報道[4-8],但關于鋁對植物吸收不同氮源的影響及其相應機制的報道較少。另外,在已有鋁對植物氮素吸收影響的報道中,對水稻之外物種的報道較多[9-13],而對水稻的報道較少[14-15],尤其對不同耐鋁水稻品種氮素吸收的比較更少。水稻是一種較為耐鋁的作物,水稻耐鋁機制的相關研究主要集中于水稻耐鋁相關的轉錄因子ART1及其調控下游與鋁耐性相關的31個基因[16-17],而對于不同耐鋁水稻品種氮轉運相關基因的研究則鮮有報道。

植物對銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸收分別由NRT (nitrate transporter)和AMT (ammonium transporter)轉運體所介導。OsNRT2;1和OsNRT2;2是水稻的2個硝酸鹽轉運體基因,主要在水稻根中表達,且為高親和硝酸鹽運輸?shù)鞍谆騕18],在低濃度NO3-下發(fā)揮作用[19]。OsAMT1;1、OsAMT1;2、OsAMT1;3是水稻銨轉運體AMT1家族的3個主要基因,對氮饑餓3周的水稻再供氮2 h后,OsAMT1;1在NH4+處理下增強表達,OsAMT1;2在NH4+誘導下在根部強烈表達,而OsAMT1;3是低豐度表達[20-21]。雖然鋁毒會影響水稻對氮素的吸收,但是鋁毒是否會影響這些基因的表達以及這些基因表達與水稻耐鋁之間的關系還不清楚。

依據(jù)以上研究背景,我們通過不同供鋁方式,研究了鋁處理對不同耐鋁水稻品種吸收銨態(tài)氮和硝態(tài)氮以及相關轉運基因表達的影響,試圖解析鋁毒對水稻氮素吸收的影響及其機制,尋求協(xié)同提高酸性土壤水稻氮素吸收和耐鋁能力的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用2個水稻品種‘Kasalath’(秈稻)以及‘Koshihikari’(粳稻)。2個品種各選取籽粒飽滿一致的適量種子,用10%的雙氧水消毒30 min,再用蒸餾水沖洗4～6遍,放置于37 ℃黑暗的恒溫箱中；待水稻種子露白即將其轉移至含有0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)的浮板上,放置于溫室在黑暗條件下萌發(fā)。

1.2 不同水稻品種耐鋁性的測定

待1.1中水稻根伸長至3～5 cm時,選取根長一致的幼苗,分別在含有0、25、50和100 μmol/L AlCl3的CaCl2溶液(0.5 mmol/L, pH 4.5)中培養(yǎng)24 h。在處理前后用直尺測量根長,每個處理10個重復,計算相對根伸長率。

1.3 不同鋁處理對水稻銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收的影響

將1.1中培養(yǎng)水稻的CaCl2溶液每隔1 d更換1次；在培養(yǎng)5 d后去除黑暗,并換上改良的木村營養(yǎng)液(pH 4.5),該營養(yǎng)液含有1 mmol/L NH4Cl、1 mmol/L NaNO3、0.18 mmol/L NaH2PO4、0.55 mmol/L KCl、0.36 mmol/L CaCl2·2H2O、0.6 mmol/L MgSO4·7H2O、20 μmol/L EDTA-Fe、50 μmol/L H3BO3、9 μmol/L MnCl2·4H2O、0.3 μmol/L CuSO4·5H2O、0.7 μmol/L CuSO4·7H2O和0.1 μmol/L NaMoO4·4H2O,每隔1 d更換1次營養(yǎng)液。待水稻生長至苗高10 cm左右時,選取生長一致的幼苗,將其轉移至約1.2 L的容器中培養(yǎng),每盆4孔,每孔2株苗。繼續(xù)每隔1 d更換1次營養(yǎng)液。水稻培養(yǎng)試驗在植物生長室內進行,光周期為光照14 h/黑暗10 h,溫度為光照(30±1) ℃/黑暗(23±1) ℃,相對濕度為65%±5%,光照強度為900 μmol/(m2·s)。在培養(yǎng)2周后,分為兩種方式處理測定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮吸收速率。(1)鋁、氮分開處理:對2周齡水稻先在不同鋁濃度(0、5、100 μmol/L AlCl3)的0.5 mmol/L CaCl2(pH 4.5)溶液中進行氮饑餓+鋁處理2 d；然后將2個水稻品種的根系分別放至含有0.2 mmol/L NH4Cl或0.2 mmol/L NaNO3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(100 mL， pH 4.5)的小黑罐中,進行氮吸收處理3.5 h。(2)鋁、氮同時處理:先在0.5 mmol/L CaCl2(pH 4.5)溶液中對2周齡水稻進行氮饑餓處理2 d；然后將2個品種的根系放至裝有0.5 mmol/L CaCl2溶液(100 mL， pH 4.5)的小黑罐中,該溶液分別含有0.2 mmol/L NH4Cl或0.2 mmol/L NaNO3以及0、5、100 μmol/L AlCl3,進行鋁+氮吸收處理3.5 h。每個處理重復4次。在吸收處理結束后,將水稻根部剪下,先于105 ℃下殺青30 min,再在75 ℃下烘干至恒重，最后稱重。測定吸收液前后重量、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度以及根干重,采用分光光度計測量溶液中硝態(tài)氮含量,用靛酚藍比色法測定溶液中銨態(tài)氮含量[22],并將銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收速率換算為單位時間內單位根重的氮素吸收量。

1.4 不同處理對水稻根系氮吸收相關基因表達的影響

處理同1.3,在收樣前先用0.1 mmol/L CaSO4洗根,再用蒸餾水潤洗1次。將根剪下,用紙將水吸干,用錫紙包裹放至液氮中速凍,在冷凍完全后,將其放入液氮預冷的滅菌研缽中研磨,然后用植物總RNA快速提取試劑盒(EASY-DO)提取根中的RNA,用NanaDrop超微量分光光度計測量RNA的質量和濃度。對符合要求的RNA用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remver試劑盒進行反轉錄。(1)RNA變性:對2 μg的RNA加無菌水至24 μL,在65 ℃下保持5 min。(2)去除基因組DNA:往上述體系中加入8 μL的4×DN Master Mix,在37 ℃下保持5 min。(3)反轉錄反應:往上述體系中加入8 μL的5×RT Master Mix Ⅱ,于37 ℃下保持15 min;在50 ℃下保持5 min;再在98 ℃下保持5 min,最后得到cDNA,將其稀釋12倍，備用。RT-PCR采用TOYOBO公司的SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒進行,反應體系10 μL: SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL、上下游引物各0.2 μL、cDNA 4.6 μL。采用實時熒光定量PCR儀器(LightCycler480II,Roch,瑞士)進行RT-PCR,反應條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 15 s,40個循環(huán);60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。相關基因的引物見表1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

相關指標的計算公式如下:相對根伸長率(%)=(LAl24-LAl0)/(L024-L00)×100%,式中LAl24為鋁處理24 h后根長,LAl0為鋁處理前根長,L024是不加鋁處理24 h后根長,L00是不加鋁處理前根長。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收速率=(C0-Ci)/t/Wi,式中C0為空白對照(不放植物)3.5 h后吸收液中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量,Ci為各個處理3.5 h后吸收液中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量,t為吸收時間,Wi為水稻根干重。

采用Excel和SPSS軟件對所得試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 2個水稻品種耐鋁性比較

從圖1可以看出：隨著鋁濃度的升高,2個品種的相對根伸長率逐漸降低;在相同鋁濃度處理下,‘Koshihikari’的相對根伸長率要顯著大于‘Kasalath’的，這表明‘Koshihikari’為相對耐鋁水稻品種,而‘Kasalath’是鋁敏感水稻品種。

2.2 不同鋁處理對不同耐鋁水稻品種吸收銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的影響

在先鋁處理然后銨態(tài)氮處理條件下,隨著鋁濃度的升高,鋁敏感品種‘Kasalath’對銨態(tài)氮的吸收速率逐漸降低,而耐鋁品種‘Koshihikari’沒有顯著變化;在不加鋁情況下,2個品種對銨態(tài)氮的吸收速率沒有顯著差異；在鋁處理下‘Koshihikari’對銨態(tài)氮的吸收速率顯著高于‘Kasalath’的(圖2A)。在先鋁處理然后硝態(tài)氮處理條件下,5 μmol/L Al處理升高了‘Kasalath’對硝態(tài)氮的吸收速率,100 μmol/L Al處理對‘Kasalath’的硝態(tài)氮吸收速率沒有影響,5和100 μmol/L Al處理對‘Koshihikari’的硝態(tài)氮吸收速率均沒有影響;在相同處理下,2個品種之間硝態(tài)氮吸收速率沒有顯著差異(圖2B)。

表1 熒光定量PCR所用引物序列

圖中不同大寫字母表示‘Kasalath’在不同鋁濃度處理下差異顯著(P<0.05,Duncan多重比較);不同小寫字母表示‘Koshihikari’在不同鋁濃度處理下差異顯著(P<0.05,Duncan多重比較);“*”表示在相同鋁濃度處理下2個品種間差異顯著(P<0.05, t檢驗)。下同。

在鋁和銨態(tài)氮同時處理下,隨著鋁濃度的升高,2個品種對銨態(tài)氮的吸收速率都呈現(xiàn)下降趨勢,但是‘Kasalath’的下降不顯著;在相同鋁濃度處理下,2個品種的銨態(tài)氮吸收速率沒有顯著差異(圖2C)。在鋁和硝態(tài)氮同時處理下,隨著鋁濃度的升高,‘Koshihikari’對硝態(tài)氮的吸收速率逐漸降低；相對于對照和100 μmol/L Al處理,‘Kasalath’在鋁濃度5 μmol/L處理下，其對硝態(tài)氮的吸收速率表現(xiàn)出一定程度的上升;在不加鋁條件下,2個品種的硝態(tài)氮吸收速率沒有顯著差異；但在鋁濃度為5和100 μmol/L下,‘Kasalath’的硝態(tài)氮吸收速率顯著高于‘Koshihikari’的(圖2D)。

圖2 不同鋁濃度對2個水稻品種銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收速率的影響

2.3 不同鋁處理對2個水稻品種銨態(tài)氮/硝態(tài)氮吸收相關基因表達的影響

對于OsAMT1;1的相對表達豐度,在鋁預處理下,隨著鋁濃度的升高,2個品種都表現(xiàn)出相同的趨勢,即在鋁濃度為5 μmol/L時,OsAMT1;1的相對表達豐度最低,且在鋁濃度為0和100 μmol/L下其表達豐度沒有顯著差異。在鋁濃度為5 μmol/L下，鋁敏感品種‘Kasalath’的OsAMT1;1相對表達豐度顯著高于耐鋁品種‘Koshihikari’的；而在鋁濃度為0和100 μmol/L下,2個品種之間沒有顯著差異(圖3A)。在鋁、氮同時處理下,2個品種在鋁濃度5和100 μmol/L時OsAMT1;1的相對表達豐度都是較低的；‘Kasalath’在鋁濃度5 μmol/L下OsAMT1;1的相對表達豐度要顯著低于在鋁濃度100 μmol/L下的；而‘Koshihikari’在鋁濃度為5和100 μmol/L下OsAMT1;1的相對表達豐度沒有顯著差異;在2個品種之間只有在鋁濃度為100 μmol/L下OsAMT1;1的相對表達豐度才有顯著差異,且‘Kasalath’顯著高于‘Koshihikari’(圖3B)。

對于OsAMT1;2的相對表達豐度,在鋁預處理下,隨著鋁濃度的升高,2個品種都表現(xiàn)出與OsAMT1;1相似的趨勢,但是在鋁濃度0、5和100 μmol/L下,‘Koshihikari’的OsAMT1;2相對表達豐度要比‘Kasalath’高出30多倍(圖3C)。在鋁、氮同時處理下,2個品種的OsAMT1;2相對表達豐度的變化趨勢依然與OsAMT1;1相似,但‘Koshihikari’的OsAMT1;2相對表達豐度也比‘Kasalath’高出30多倍(圖3D)。

在鋁預處理下,對于‘Kasalath’,在5和100 μmol/L鋁濃度下，OsNRT2;1的相對表達豐度相對于對照都顯著下降,且在5 μmol/L鋁處理下要顯著低于在100 μmol/L鋁處理下的；對于‘Koshihikari’,在5 μmol/L鋁濃度下OsNRT2;1的相對表達豐度顯著高于對照的,而在100 μmol/L鋁濃度下顯著低于對照的;在相同鋁濃度下,‘Koshihikari’中OsNRT2;1的相對表達豐度都顯著高于‘Kasalath’的(圖4A)。在鋁、氮同時處理下，2個品種在鋁處理下OsNRT2;1的相對表達豐度都比對照顯著降低,且在鋁濃度為0和100 μmol/L下,‘Koshihikari’的相對表達豐度顯著高于‘Kasalath’的(圖4B)。

圖3 不同鋁濃度對2個水稻品種中OsAMT1;1和OsAMT1;2相對表達豐度的影響

在鋁預處理下,‘Kasalath’在鋁濃度5 μmol/L處理下OsNRT2;2的相對表達豐度最高(圖4C)。在鋁、氮同時處理下,‘Kasalath’在鋁濃度100 μmol/L下OsNRT2;2的相對表達豐度最高,但在鋁濃度0和5 μmol/L處理之間沒有顯著差異(圖4D)。另外，OsNRT2;2在‘Koshihikari’中沒有檢測到表達。

3 討論

植物受鋁毒危害后的主要癥狀是根伸長受到抑制[6],因此相對根伸長率一般用來評價植物的耐鋁能力。本研究發(fā)現(xiàn)，在鋁處理24 h之后,‘Kasalath’的根伸長受鋁抑制程度高于‘Koshihikari’,表明‘Kasalath’是鋁敏感品種而‘Koshihikari’為耐鋁品種,這與以前報道[23-24]中2個品種的耐鋁評價結果一致。

據(jù)報道[15],在50 μmol/L鋁處理下,水稻表現(xiàn)出硝態(tài)氮吸收下降的趨勢;也有研究表明,在鋁濃度0～185 μmol/L處理下,鋁會促進對硝態(tài)氮的吸收,而在之后隨著鋁濃度的升高硝態(tài)氮的吸收呈現(xiàn)降低趨勢[14]。在其他物種如大豆中也發(fā)現(xiàn),低于10 μmol/L鋁處理會促進硝態(tài)氮的吸收,高于10 μmol/L鋁處理則抑制大豆對硝態(tài)氮的吸收[9]。在本研究中,鋁預處理以及鋁氮同時處理對2個品種硝態(tài)氮吸收的影響不盡相同。以前報道表明,在鋁預處理的吸收實驗中,鋁對于硝態(tài)氮的吸收影響較小[25]。在本研究中,低濃度(5 μmol/L)鋁預處理以及鋁氮同時處理對敏感品種硝態(tài)氮吸收均有一定的促進作用,而高濃度鋁處理對敏感品種硝態(tài)氮吸收的影響較小;耐鋁品種對硝態(tài)氮的吸收速率受鋁預處理影響不大,而在吸收過程中加入鋁后,其硝態(tài)氮的吸收速率逐步下降,這與相對根伸長率的表現(xiàn)不一致,這可能是因為3.5 h處理還并未影響到根伸長,而硝態(tài)氮吸收可能是直接受到鋁的影響而并非是由于根的伸長受到影響。另外從硝態(tài)氮吸收相關基因的相對表達豐度來看,雖然耐鋁品種的OsNRT2;1相對表達豐度要顯著高于鋁敏感品種的,但是OsNRT2;2在耐鋁品種中并沒有檢測到表達,這也可以解釋鋁敏感品種對硝態(tài)氮的吸收速率高于耐鋁品種。

鋁敏感品種‘Kasalath’對硝態(tài)氮的吸收要快于耐鋁品種‘Koshihikari’；而對于銨態(tài)氮來說,情況有所不一樣,在鋁預處理之后,耐鋁品種的銨態(tài)氮吸收速率要高于敏感品種,這支持“耐鋁植物一般偏好銨態(tài)氮,不耐鋁植物一般偏好硝態(tài)氮”的論述[26]。同時,在鋁處理下,銨態(tài)氮的吸收速率都有被抑制的趨勢,這與前人的研究結果[14]一致。但是本實驗發(fā)現(xiàn)，在預處理鋁濃度為5 μmol/L時銨態(tài)氮吸收速率略微有所上升,可能是由于低濃度的鋁預處理并沒有對耐鋁品種的根生長造成負面影響,反而稍微促進了根對營養(yǎng)物質的吸收,這一點對于銨態(tài)氮和硝態(tài)氮都一樣。本研究結果表明：與鋁預處理相比,銨態(tài)氮吸收相關基因OsAMT1;1和OsAMT1;2的相對表達豐度受到鋁和銨態(tài)氮同時處理的抑制作用更加明顯。對于OsAMT1;1,2個品種的相對表達豐度沒有什么差別,而對于OsAMT1;2,‘Koshihikari’的相對表達豐度是‘Kasalath’的30多倍?？赡躉sAMT1;2相對表達豐度的差別是耐鋁品種和鋁敏感品種之間的一個顯著標志,這與銨態(tài)氮的吸收結果一致,說明OsAMT1;2相對表達豐度的升高可能是銨態(tài)氮吸收增加的一個因素。我們還進一步證明了鋁對水稻吸收銨態(tài)氮速率的影響要小于對硝態(tài)氮吸收速率的影響,這與在其他物種上的研究結果[13]類似。至于在水稻中產生這種現(xiàn)象是否與部分研究所揭示的水稻喜銨相關,還需要進一步的研究。綜上推測,OsAMT1;2、OsNRT2;1和OsNRT2;2的表達差異可能與水稻的耐鋁性差異有關。

圖4 不同鋁濃度對2個水稻品種OsNRT2;1和OsNRT2;2相對表達豐度的影響

4 結論

鋁對不同耐鋁水稻品種銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收的作用不同。對于鋁敏感品種‘Kasalath’,鋁的抑制作用主要體現(xiàn)在銨態(tài)氮吸收速率方面,對于硝態(tài)氮的吸收,低濃度的鋁甚至有一定的促進作用;而對于耐鋁品種‘Koshihikari’,鋁處理方式對銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收有不同的影響,在預處理中添加鋁的方式幾乎不會對‘Koshihikari’吸收銨態(tài)氮和硝態(tài)氮速率有影響,只有在銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收過程中存在鋁,無論鋁濃度的高低,鋁都會對銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收產生抑制的作用。相對來說,鋁敏感品種對硝態(tài)氮的吸收速率要比耐鋁品種高,而耐鋁品種對銨態(tài)氮的吸收速率比鋁敏感品種高一些,這與OsAMT1;2、OsNRT2;1和OsNRT2;2的相對表達豐度結果吻合。上述研究結果為進一步研究水稻耐鋁與銨態(tài)氮/硝態(tài)氮吸收基因相關的分子機制提供了重要信息。