兒童造血干細(xì)胞移植后EB 病毒相關(guān)淋巴組織增殖性疾病 的診療進(jìn)展

習(xí)必鑫，胡 群

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒童血液科（湖北武漢 430030）

EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種自然界中廣泛存在的γ 皰疹病毒，容易感染人類B 淋巴細(xì)胞，全世界50%～ 89%的兒童和90%以上的成年人可以檢測(cè)出血清EBV-IgG陽(yáng)性[1]。對(duì)于免疫功能正常的個(gè)體，體內(nèi)EBV 特異性細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）可以有效控制EBV 感染，從而長(zhǎng)期處于EBV 感染的無(wú)癥狀潛伏期；但是當(dāng)人體免疫功能障礙時(shí)，如造血干細(xì)胞移植后，患兒可能出現(xiàn)頑固性EBV 血癥，甚至進(jìn)展為致命性的EBV 相關(guān)淋巴組織增殖性疾病（EBV related post-transplant lymphoproliferative disorder，EBV-PTLD）[2]。對(duì)234個(gè)移植中心的18 014例患者分析發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplant，HSCT）術(shù)后PTLD的病死率為84.6%[3]。PTLD 的傳統(tǒng)治療包括使用抗病毒藥物、免疫抑制劑逐漸減量、供體淋巴細(xì)胞輸注（donor lymphocyte infusion，DLI）等，但治療效果并不理想，而且完全緩解率低。近年來(lái)，隨著特異性CD20靶向藥物，利妥昔單抗的成功應(yīng)用，聯(lián)合化療、EBV特異性CTL、嵌合抗原受體T細(xì)胞治療（chimeric antigen receptor T-cell therapy，CAR-T）等治療方式均被證實(shí)可顯著改善EBV-PTLD患者的預(yù)后[4]。

1 EBV-PTLD發(fā)病機(jī)制

EBV可通過(guò)其靶受體CD21感染人體 B淋巴細(xì)胞，在宿主免疫功能正常時(shí)絕大部分被感染的B淋巴細(xì)胞會(huì)被EBV特異性的CTL和自然殺傷細(xì)胞清除，極少部分被EBV感染的靜息記憶B淋巴細(xì)胞逃過(guò)免疫追蹤。擁有近100 組基因序列的EBV 通過(guò)限制自身核酸序列的表達(dá)，從而阻止CTL對(duì)感染的靜息B淋巴細(xì)胞的識(shí)別，使宿主長(zhǎng)期處于無(wú)癥狀感染期。此外，EBV 還可以通過(guò)表達(dá)潛伏期膜蛋白（latent membrane protein，LMP）激活靜息B 淋巴細(xì)胞中的JAK/STAT 通路，從而上調(diào)共抑制受體PD-L1的表達(dá)[1]。當(dāng)EBV與PD-1受體結(jié)合后，CTL 無(wú)法識(shí)別EBV，導(dǎo)致免疫失能。盡管人體EBV潛伏感染很常見，但仍有少部分個(gè)體會(huì)發(fā)展為與EBV相關(guān)的淋巴瘤，這類人群通常受種族、地理位置、生活環(huán)境、遺傳免疫和感染等因素的影響。

當(dāng)患者特異性T 淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)受損時(shí)，被EBV感染的B淋巴細(xì)胞生存期延長(zhǎng)，進(jìn)一步增加了B淋巴細(xì)胞變異的可能性，比如BCL 6、MYC、NF-kB、PI 3 K/AKT/mTOR、BCL 2等變異，甚至可能導(dǎo)致淋巴細(xì)胞組織從早期多態(tài)型淋巴瘤病變逐步發(fā)展到更高危類型的單克隆或寡克隆淋巴瘤病變[1]。實(shí)體器官移植或HSCT 創(chuàng)造了一種獨(dú)特的免疫功能障礙環(huán)境，為受者體內(nèi)感染EB 病毒的B 淋巴細(xì)胞逐漸演變成PTLD提供了適宜條件。此外，早發(fā)型PTLD具有EBV依耐性，晚發(fā)型PTLD 并不具有EBV 依耐性[5]。大部分EBV 陽(yáng)性的PTLD 發(fā)生在移植后前6 個(gè)月內(nèi)，而EBV 陰性的PTLD 則多發(fā)生于移植5 年以上的患者。在基因組水平上，兩者也存在著顯著差異：免疫系統(tǒng)正常時(shí)，EBV陰性患者與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤具有相同的基因組特征，而EBV 陽(yáng)性患者則沒有這類特 征[6]。此外，EBV 陰性的PTLD 比EBV 陽(yáng)性的PTLD存在更多更復(fù)雜的分子畸變。盡管EBV陽(yáng)性的PTLD和EBV陰性的PTLD之間存在明顯的差異，但是它們對(duì)治療有著相似的反應(yīng)，即EBV的感染狀態(tài)似乎并不影響PTLD的預(yù)后。

2 EBV-PTLD危險(xiǎn)因素

近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)供體的來(lái)源、供受者HLA抗原的匹配程度、減低強(qiáng)度的預(yù)處理（reduced intensity conditioning，RIC）、移植物抗宿主?。╣raft-versushost disease，GVHD）、抗胸腺球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）的使用、T細(xì)胞去除（T cell depletion，TCD）、臍血移植（umbilical cord blood trarsplantation，UCBT）、脾切除及供受者EBV 血清學(xué)錯(cuò)配等危險(xiǎn)因素均可以明顯增加EBV-PTLD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并且隨著危險(xiǎn)因素?cái)?shù)量在移植受體的累積，其EBV-PTLD發(fā)生的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值（Relative Risk,RR）呈非對(duì)稱性的幾何倍數(shù)增長(zhǎng)[1,3,5,7]。見表1。

2.1 降低預(yù)處理強(qiáng)度

對(duì)于再生障礙性貧血或先天性免疫缺陷病患者，臨床醫(yī)生為了降低預(yù)處理藥物的毒性和受體HSCT后的早期死亡率，通常會(huì)選擇減低強(qiáng)度的預(yù)處理方案。對(duì)1 021 例移植患者的分析發(fā)現(xiàn)，其中4%患者發(fā)生PTLD，證實(shí)RIC是發(fā)生PTLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7]。RIC對(duì)PTLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響也可以用EBV對(duì)B淋巴細(xì)胞的趨向性來(lái)解釋。移植患者接受RIC后，體內(nèi)EBV感染的淋巴細(xì)胞由于缺乏正常EBV 特異性CTL 的免疫限制，其自由轉(zhuǎn)化期明顯延長(zhǎng)。與清髓性預(yù)處理方案相比，RIC受體需要更高強(qiáng)度的抗排異治療，因此更容易出現(xiàn)特異性T細(xì)胞重建延遲[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，接受RIC方案移植的患兒中，9例中僅1例在移植后6個(gè)月，10 例中7 例在移植后1 年，可以檢測(cè)到EBV 特異性CTL，而標(biāo)準(zhǔn)清髓方案（myeloablative conditioning，MAC）處理移植的患兒中，9 例中有6 例在移植后6個(gè)月、10 例均在移植后1年，可以檢測(cè)到EBV 特異性CTL[3]。

2.2 HLA抗原相合程度

供體和受體HLA 抗原不匹配導(dǎo)致PTLD 發(fā)生的分子機(jī)制目前仍不清楚。但是，研究發(fā)現(xiàn)，HLA 抗原錯(cuò)配的移植受者比HLA 抗原全相合移植受者發(fā)生EBV-PTLD 的風(fēng)險(xiǎn)更高[7]。此外，有2 個(gè)或以上HLA抗原位點(diǎn)不匹配或無(wú)關(guān)供者的移植受體發(fā)生PTLD的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于HLA 全相合或僅有1 個(gè)HLA 抗原位點(diǎn)不匹配同胞供體的移植患者[5]。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，HLA -I類抗原與EBV-PTLD的發(fā)生沒有相關(guān)性[1]。

表1 EBV-PTLD危險(xiǎn)因素

2.3 抗胸腺球蛋白或T細(xì)胞去除

近年來(lái)單倍體半相合受體HSCT 的數(shù)量不斷增加，為了降低受體移植后GVHD 的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，移植前ATG或TCD的使用也越來(lái)越多；但研究發(fā)現(xiàn)，ATG 或TCD 的使用均可能導(dǎo)致EBV 復(fù)燃，從而增加PTLD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1,9]。根據(jù)抗體生產(chǎn)方式和動(dòng)物來(lái)源不同，ATG 包括兔抗-ATG-G、兔抗-ATG-F、馬抗-ATG-G、馬抗-ATG-F 等，一項(xiàng)針對(duì)兒童HSCT 的回顧性研究證實(shí)，5～10 mg/kg ATG-G和20～60 mg/kg ATG-F在免疫重建方面沒有明顯差異，但是后者會(huì)導(dǎo)致更高的PTLD發(fā)生率[10]。此外，兔抗-ATG還可以引起更強(qiáng)的淋巴細(xì)胞耗竭。非選擇性的TCD常用阿倫單抗（抗CD52抗體）或者密度梯度離心來(lái)處理移植物采集物，它可以大量清除T 淋巴細(xì)胞，其中也包括EBV特異性CTL。由于特異性T淋巴細(xì)胞的減少與EBV感染、巨細(xì)胞病毒（CMV）感染均密切相關(guān)，而且移植前使用TCD 的受者PTLD 發(fā)生率高[3]，因此，國(guó)內(nèi)大部分醫(yī)療中心很少使用TCD。

2.4 移植物抗宿主病

GVHD是受體HSCT常見的并發(fā)癥，持續(xù)的抗原刺激，會(huì)誘發(fā)炎癥性細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而導(dǎo)致受體特異性免疫系統(tǒng)重建延遲[11]。同時(shí)，抗排異藥物的免疫抑制治療也會(huì)增加受體感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，GVHD是患者HSCT 后發(fā)生EBV-PTLD 的又一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn) 因素[5,12]。單因素和多因素分析顯示，Ⅱ～Ⅳ級(jí)急性GVHD 和慢性GVHD 患者發(fā)生EBV 血癥的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，而且GVHD 越嚴(yán)重PTLD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也 越高[7,13]。

2.5 臍血移植

UCBT具有低輸入性感染風(fēng)險(xiǎn)、低GVHD發(fā)生率等優(yōu)點(diǎn)，而且隨時(shí)可用，因此適用于先天性免疫缺陷病以及與供者HLA 抗原錯(cuò)配的移植患者。UCBT、骨髓移植和外周血干細(xì)胞移植后EBV 相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率沒有明顯差異。但是，研究顯示，使用RIC預(yù)處理方案的UCBT 患者PTLD 發(fā)生率為6%～7%，而使用RIC+ATG 預(yù)處理方案的UCBT 患者PTLD 發(fā)生率則高達(dá)21%[1]，因此，需要加強(qiáng)對(duì)UCBT患者血清EBVDNA 載量的監(jiān)測(cè)，必要時(shí)可預(yù)防性使用利妥昔單抗 治療。

2.6 CMV感染

移植受體HSCT 后，免疫功能處于抑制狀態(tài)且白細(xì)胞數(shù)量低下，容易感染各種病原微生物，包括細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等。其中，CMV與骨髓抑制、GVHD、EBV再活化等一系列移植后并發(fā)癥密切相關(guān)。研究人員通過(guò)多變量分析發(fā)現(xiàn)，CMV 再活化也是預(yù)測(cè)EBV再激活和PTLD發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]。

2.7 脾切除

脾是人體免疫系統(tǒng)非常重要的一個(gè)組成部分，它是T細(xì)胞、B細(xì)胞和免疫球蛋白產(chǎn)生的重要場(chǎng)所。脾切除會(huì)損害CD 5+B 細(xì)胞的免疫功能，可能誘發(fā)EBV 的活化和爆發(fā)性增殖。研究發(fā)現(xiàn)，脾切除是EBV-PTLD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。

2.8 其他危險(xiǎn)因素

全身放療、基礎(chǔ)疾?。ū热缰匦驮偕系K性貧血、非霍奇金淋巴瘤等）、年齡、移植+30d CD4+淋巴細(xì)胞數(shù)量、供受體EBV血清學(xué)不匹配、移植后環(huán)磷酰胺的使用等均被證實(shí)為PTLD 危險(xiǎn)因素[1,3,5,7]。此外，有研究表明，多個(gè)EBV-PTLD 危險(xiǎn)因素累積時(shí)，其發(fā)病的RR顯著升高，患者的發(fā)病時(shí)間顯著縮短；當(dāng)累積的危險(xiǎn)因素≥2個(gè)時(shí)，EBV-PTLD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組（0個(gè)危險(xiǎn)因素）的43倍，其發(fā)病的中位時(shí)間縮短到移植后9.6個(gè)月[5,7]。

3 EBV監(jiān)測(cè)及預(yù)防

3.1 EBV監(jiān)測(cè)

健康個(gè)體的外周血單核細(xì)胞中很容易檢測(cè)到EBV-DNA，而血漿中游離的EBV-DNA 檢測(cè)通常為陰性，此時(shí)宿主處于EBV 感染的潛伏期。但是，血漿EBV-DNA 陽(yáng)性時(shí)則表明其可能來(lái)源于被EBV 感染的死亡腫瘤細(xì)胞、死亡的潛伏感染的B淋巴細(xì)胞或者EB 病毒體。因此，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）監(jiān)測(cè)血漿EBV 載量對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)EBV 血癥、淋巴細(xì)胞組織增生性疾病顯得十分重要。根據(jù)最新的血液病多中心臨床指南建議[16]，移植后患者血細(xì)胞重建時(shí)，就應(yīng)開始監(jiān)測(cè)血漿EBV-DNA，一般為移植后2周左右，每周 1 次，至少監(jiān)測(cè)到受體細(xì)胞免疫重建4 個(gè)月后。若EBV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性，則監(jiān)測(cè)頻率改為每周2次。

3.2 EBV感染的預(yù)防

移植預(yù)處理前即給予患兒靜脈輸注更昔洛韋，預(yù)防性抗病毒治療；造血干細(xì)胞回輸-1 d，調(diào)整更昔洛韋為阿昔洛韋靜脈輸注，至少持續(xù)至造血細(xì)胞完全植入。對(duì)于供者為單倍體半相合及預(yù)處理方案包含ATG的移植受體，移植前可以考慮預(yù)防性使用利妥昔單抗治療（375 mg/m2）[1]。

4 EBV-PTLD診斷

4.1 臨床表現(xiàn)

≥1 項(xiàng)臨床癥狀：無(wú)法解釋的持續(xù)發(fā)熱（體溫≥38.0 ℃）、陣發(fā)性頭痛、頻繁嘔吐、持續(xù)腹瀉、間斷性血便、四肢乏力等；臨床工作中以無(wú)明確病因的發(fā)熱更多見。≥1項(xiàng)陽(yáng)性體征：扁桃體腫大、咽喉部淋巴濾泡組織明顯增多增大、淺表淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大、皮膚鞏膜黃染等；臨床工作中以頸部、腋窩、腹股溝等部位的淋巴結(jié)腫大更多見。

4.2 影像學(xué)檢查

根據(jù)患者的疾病狀態(tài)，可以選擇雙側(cè)頸部、雙側(cè)腋窩、胸部、腹部、盆腔、雙側(cè)腹股溝等腫塊常見部位行B 超、CT 掃描、核磁共振成像（MRI）、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層顯像儀（positron emission tomography and computed tomography，PET-CT）檢查來(lái)明確病變的大小和性質(zhì)。對(duì)于有持續(xù)嘔吐、腹痛、腹瀉、消瘦等癥狀的患兒，可以考慮行經(jīng)消化道內(nèi)鏡檢查及活檢。

4.3 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

連續(xù)兩次血清或腦脊液EBV-DNA ≥104拷貝/mL、克隆性免疫球蛋白重鏈或T細(xì)胞受體基因重排陽(yáng)性、外周血出現(xiàn)異型淋巴細(xì)胞、外周血血細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低（累及骨髓時(shí)可出現(xiàn)一系或多系血細(xì)胞減少）、乳酸脫氫酶（LDH）≥3倍正常值上限等。

4.4 組織病理活檢

選取腫大的組織包塊（優(yōu)先選擇氟代脫氧葡萄糖高代謝富集區(qū)域）進(jìn)行病理活檢，EBV-PTLD 的組織病理學(xué)特征[16]包括：淋巴細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致結(jié)內(nèi)或結(jié)外組織結(jié)構(gòu)的破壞、免疫組化標(biāo)記顯示為單克隆或寡克隆細(xì)胞群、組織細(xì)胞（非血液成分）中可以檢測(cè)出EBV 核酸或EBV 編碼蛋白（2016 年歐洲白血病感染會(huì)議指南[16]推薦具有高靈敏性、高特異性的原位雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)EBV編碼的小RNA,EBV-encoded small RNA,即EBER），確診EBV-PTLD必須符合上述三種組織病理學(xué)特征中的兩種，此為診斷EBV-PTLD的金標(biāo)準(zhǔn)；其具體的病理類型可參照2016年世界衛(wèi)生組織更新的PTLD組織病理學(xué)分類[17]。

5 臨床治療進(jìn)展

5.1 EBV血癥的治療

臥床休息，清淡飲食，維持水、電解質(zhì)平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，監(jiān)測(cè)體溫、血壓、心率等生命體征變化。根據(jù)病情監(jiān)測(cè)血常規(guī)、血生化（心肌酶譜、肝功能、腎功能、電解質(zhì)等）、凝血功能、血糖、血清EBV-DNA、血清CMV-DNA、外周血T/B/NK細(xì)胞EBV核酸分選，必要時(shí)復(fù)查胸部CT及淋巴結(jié)B超等檢查。

抗病毒治療，更昔洛韋+膦甲酸鈉或者阿昔洛韋+膦甲酸鈉靜脈輸注，其中膦甲酸鈉用藥過(guò)程中須給予水化，總液體量2 000～2 500 mL/m2。

連續(xù)2次血清學(xué)EBV-DNA≥104拷貝/mL，即可考慮給予患兒抗排異藥逐漸減量聯(lián)合利妥昔單抗搶先治療（375 mg/m2，每周1次，1～4周）。

5.2 EBV-PTLD的治療

在對(duì)癥支持治療的基礎(chǔ)上，積極防治移植后并發(fā)癥；盡快完善PET-CT、組織病理活檢，EBV-PTLD一旦確診，立即給予患兒化療或者細(xì)胞免疫治療。

5.2.1 化療 利妥昔單抗（抗CD 20+特異性單克隆抗體）目前已成為臨床上治療早期非破壞性PTLD、多形性破壞性PTLD 及單形性破壞性PTLD（包括彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤樣PTLD）的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物。利妥昔單抗可以有效治療EBV-PTLD，其作用機(jī)制主要包含兩個(gè)方面：①靶向清除CD20+的腫瘤細(xì)胞；②高效耗竭體內(nèi)B淋巴細(xì)胞，明顯消減了EBV感染的B淋巴細(xì)胞，從而相對(duì)提高受者體內(nèi)EBV特異性T淋巴細(xì)胞的比例，促進(jìn)機(jī)體抗病毒及抗腫瘤的免疫反應(yīng)[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)多中心治療兒童EBV-PTLD化療方案并不一致，包括R-CP、R-CHOP 及SC-EPOCH 等化療方案，其中減低劑量的R-CP 方案[第1、2 療程，環(huán)磷酰胺 600 mg/m2d1，甲基潑尼松龍 1.6mg/（kg·d）iv d1-d5；利妥昔單抗 375mg/m2d1、d8、d15；第3～6療程，環(huán)磷酰胺 600mg/m2d1，甲基潑尼松龍 1.6mg/（kg·d）iv d1-d5]應(yīng)用較廣泛，但是該治療方案的安全性和有效性仍在進(jìn)一步完善中。

5.2.2 細(xì)胞免疫治療 EBV 特異性CTL 免疫療法，對(duì)于利妥昔單抗耐藥或者復(fù)發(fā)的EBV-PTLD 治療效果顯著。如果供體來(lái)源的EBV-CTL 無(wú)法獲得或者供體血清EBV 陰性，可以選擇與第三方HLA 抗原全相合的EBV-CTL 來(lái)治療EBV-PTLD，也能獲得很好的長(zhǎng)期完全緩解[1,18]。CAR-T 免疫療法，通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)使患者的T細(xì)胞能夠表達(dá)嵌合抗原受體CAR，然后將改造后的CAR-T 細(xì)胞回輸給患兒，從而靶向清除腫瘤細(xì)胞。目前的CAR-T 治療主要針對(duì)CD 19、CD 20、CD22三個(gè)靶向位點(diǎn)。DLI，即血清學(xué)EBV-IgG陽(yáng)性的供體淋巴細(xì)胞輸注，在受體T細(xì)胞免疫功能完全重建之前，也可以有效治療EBV-PTLD，但是有研究報(bào)道EBV-PTLD患者接受DLI治療后，GVHD發(fā)生率高達(dá)17%[1]，因此臨床診療過(guò)程中須密切關(guān)注由于DLI 引發(fā)嚴(yán)重GVHD的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，EBV-PTLD是兒童HSCT后的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，進(jìn)展迅速，死亡率高，預(yù)后差。由于兒童PTLD發(fā)病率低、相關(guān)的臨床試驗(yàn)少、治療方案不一致，因此，目前國(guó)際上還沒有形成統(tǒng)一的EBV-PTLD治療方案。盡管多中心臨床試驗(yàn)正在尋找新的治療方式和靶向藥物，但是仍有太多未知的困難，還需要進(jìn)行更多的前瞻性研究來(lái)完善兒童EBV-PTLD 治療的有效性和安全性。