無腦回-巨腦回畸形患兒的臨床特征及分子遺傳學研究

周昀箐 王翠錦 王英燕 陳 麗 禹永春 王紀文

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心（上海 200127）；2.復旦大學腦科學研究院（上海 200032）

無腦回-巨腦回畸形是一種罕見的腦畸形，由胚胎發(fā)育過程中的神經元遷移缺陷引起?；純和ǔ１憩F為嚴重的精神運動發(fā)育遲緩和難治性癲癇。目前已發(fā)現病因與孕期感染、放射性接觸及多種基因變異等相關。無腦回-巨腦回畸形的病因學及合并難治性癲癇的治療選擇是臨床待解決的問題，既往國內報道較少。本研究分析無腦回-巨腦回畸形患兒的臨床表現及遺傳學特征，總結治療及效果，探索基因型-表型關聯及遺傳學病因。

1 臨床資料

2014 年1 月至2020 年3 月在上海交通大學醫(yī)學院附屬上海市兒童醫(yī)學中心就診，經頭顱磁共振成像（MRI）確診的無腦回-巨腦回畸形患兒共60例，男30 例、女30 例，起病年齡2 天至14 歲，中位年齡4 個月。56 例（93.3%）1 歲內起?。缓喜Ⅲ@厥發(fā)作50 例（83.3%），其中嬰兒痙攣癥30例、大田原綜合征1例、非綜合征類癲癇性腦病16 例、局灶性癲癇1 例、熱性驚厥2例，無驚厥發(fā)作、僅以運動或語言發(fā)育落后就診10例（16.7%）。癲癇發(fā)作類型為單一發(fā)作形式34例，其中單一痙攣發(fā)作18 例、單一強直陣攣發(fā)作7 例、單一局灶性發(fā)作9例；合并2種以上發(fā)作形式16例，6例痙攣發(fā)作合并局灶性發(fā)作、3 例痙攣發(fā)作合并強直發(fā)作及局灶性發(fā)作、2例局灶性發(fā)作合并強直陣攣發(fā)作、2例痙攣發(fā)作合并局灶性發(fā)作及肌陣攣發(fā)作、1例強直發(fā)作合并局灶性發(fā)作、1例痙攣發(fā)作合并肌陣攣發(fā)作、1例痙攣發(fā)作合并強直發(fā)作及強直-痙攣發(fā)作。最常見的發(fā)作類型是痙攣發(fā)作，共 31例（62.0%）。

患兒影像學檢查顯示單純巨腦回45例（75.0%），單純無腦回4 例（6.7%），巨腦回合并無腦回11 例（18.3%）；45例單純巨腦回畸形中，廣泛性巨腦回24例、局灶性巨腦回21例（半球8例、額部2例、額頂部1例、額顳部3例、額顳頂部5例、顳部1例、顳頂枕部1例）。見圖1。

50 例合并驚厥發(fā)作的無腦回-巨腦回患兒，2 例熱性驚厥未用抗癲癇藥物；余48 例均使用了抗癲癇藥物治療，其中11 例使用1種抗癲癇藥物，12 例使用2種抗癲癇藥物，25例使用3種及以上抗癲癇藥物。托吡酯是使用最多的藥物，共30例患兒使用，無發(fā)作及發(fā)作減少50%以上的6 例。31 例發(fā)作類型為痙攣發(fā)作的患兒，其中10例曾使用促皮質素（Corticotropin，ACTH）治療，2例治療后無發(fā)作，2例發(fā)作減少；12例使用氨己烯酸治療，其中1 例無發(fā)作，4 例發(fā)作減少。丙戊酸和左乙拉西坦也是使用較多的藥物，均為23例，各有2例治療后無發(fā)作。5例使用奧卡西平治療的患者中2 例無發(fā)作。10 例使用氯硝西泮的患者中僅1例無發(fā)作。1例患兒使用了拉莫三嗪治療后無發(fā)作。苯巴比妥和硝西泮治療效果較差，使用后患兒發(fā)作均無明顯改善。

圖1 患兒頭顱MRI

除藥物治療外，5 例患兒行癲癇手術治療，術前均存在藥物難治性癲癇。2 例患兒頭顱MRI示右額局灶性巨腦回，表現為局灶性發(fā)作；其中1 例生后45 天起病，丙戊酸、左乙拉西坦治療無效，2歲時行右額切除術后隨訪1年無發(fā)作；另1例2歲起病，多種抗癲癇藥物治療無效，4歲行右額切除術后隨訪4年無發(fā)作。1例左側半球巨腦回患兒生后10天起癲癇發(fā)作，表現為強直發(fā)作及局灶性發(fā)作，予多種抗癲癇藥物治療無效，8 月齡行半球切除術后隨訪5 月無發(fā)作。1 例患兒頭顱MRI示右側半球巨腦回，生后40天起痙攣發(fā)作，丙戊酸、奧卡西平治療無效，13 月齡行迷走神經刺激術后隨訪22 個月無發(fā)作。1 例廣泛性巨腦回患兒4 月齡起痙攣發(fā)作，使用ACTH 等多種藥物治療無效，1歲行迷走神經刺激術、1 歲半行胼胝體切開術后發(fā)作 好轉。

50例合并驚厥發(fā)作的患兒隨訪時間1.5個月至5年，1例廣泛性巨腦回患兒4.5月齡起痙攣發(fā)作，丙戊酸、托吡酯治療無效，6 月齡時因重癥肺炎死亡，2 例熱性驚厥及16例癲癇患兒（18/50，36.0%）發(fā)作控制，31 例（31/50,62.0%）發(fā)作未得到有效控制。60 例患兒中僅1例14歲起病的患兒智力運動發(fā)育無異常，表現為局灶性癲癇，頭顱MRI示右側額顳頂巨腦回，奧卡西平治療有效，隨訪3年無發(fā)作，成績中等，無運動障礙；其余59 例患兒存在不同程度的認知、運動、語言發(fā)育落后或倒退。

經監(jiān)護人簽署知情同意，醫(yī)院倫理委員會批準，對45 例患兒及其父母進行全基因組測序。采集患兒及其父母外周血2 mL，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝試管，充分混勻；取200 μL全血，使用QIAampDNA Blood Mini Kit 試劑盒（Qiagen，德國）提取基因組DNA，用NanoDrop 2000 分光光度計對所提DNA定量。采用高通量測序進行致病基因鑒定。取3 μg患兒的基因組DNA經M220型核酸打斷儀（美國Covaris公司）處理后得到150～200 bp 的DNA 片段，采用SureSelect 試劑盒（美國Agilent 公司）制備測序文庫。使用HiSeq 2500 System（Illumina，美國）行高通量測序。將得到的DNA 序列變異包括單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNP）和插入缺失（insertion deletion，InDel）位點與人類參考基因組比對。應用Ingenuity 軟件對變異進行篩選。結果發(fā)現1 例TUBA1A基因存在c.1204C＞T變異，4例PAFAH1B1基因存在變異，分別為c.569-10 T＞C、c.337 C＞T、c.1002+1G＞A、c.265C＞T。所有變異均為新發(fā)變異，患兒父母未見變異；變異位點均引起蛋白質功能的改變，美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）分類均為致病性突變。

TUBA 1 A基因c.1204 C＞T 錯義變異位點所在的密碼子是TUBA 1 A基因變異的熱點區(qū)域。存在c.1204C＞T錯義變異的患兒，2月齡時以驚厥發(fā)作起病，存在多種發(fā)作形式（痙攣發(fā)作、強直發(fā)作、強直-痙攣發(fā)作），伴精神運動發(fā)育遲緩；頭顱MRI 提示巨腦回-無腦回畸形及胼胝體發(fā)育不良；曾使用丙戊酸、托吡酯、氨己烯酸、維生素B6治療，仍有反復驚厥發(fā)作。

存在PAFAH 1 B 1基因變異的4 例患兒，1 例位于第5 號外顯子的c.265 C＞T 錯義變異的患兒，因發(fā)育落后就診，13 月齡時無法獨坐、翻身，頭顱MRI 示廣泛性巨腦回，康復治療中；1例位于第6號內含子與第7號外顯子的交界區(qū)域的c.569-10T＞C剪接位點變異的患兒5月齡時發(fā)現痙攣發(fā)作、局灶性發(fā)作，伴發(fā)育落后，頭顱MRI 示兩側廣泛性巨腦回，后頭部顯著，使用托吡酯、丙戊酸、氨己烯酸、硝西泮抗癲癇治療，現發(fā)作稀少；1例位于第5號外顯子的c.337C＞T無義變異的患兒表現為痙攣發(fā)作，伴發(fā)育落后，頭顱MRI示廣泛性無腦回-巨腦回畸形，使用丙戊酸、托吡酯抗癲癇治療后仍每日有痙攣發(fā)作；1 例位于第9 號外顯子與內含子的交界區(qū)域的c.1002+1G＞A剪接位點變異的患兒8月齡時發(fā)現運動落后，4歲出現痙攣發(fā)作，頭顱MRI 示兩側廣泛性巨腦回畸形、后頭部顯著，伴智力、運動發(fā)育落后，丙戊酸、托吡酯治療后仍有發(fā)作。

2 討論

腦回畸形包括無腦回、巨腦回和皮質下帶狀異位等，是由于在妊娠12 周至24 周的胚胎發(fā)育過程中神經細胞遷移的缺陷導致的，病因與孕期感染、中毒及基因變異等有關。無腦回-巨腦回畸形的發(fā)病率尚不確定，估計在每百萬新生兒11.7至40例之間[1]。無腦回-巨腦回畸形患兒常表現出明顯的發(fā)育遲緩及難治性癲癇。

無腦回-巨腦回畸形患兒常合并難治性癲癇。本組病例中約94.0%患兒的癲癇是在出生后第一年內發(fā)生的，60.7%的癲癇為藥物難治性癲癇，這與既往發(fā)表的研究數據相似[2]。然而，關于無腦回-巨腦回畸形患者抗癲癇藥物療效的數據很少[3]。有報道22例與PAFAH1B1/LIS1基因相關的無腦回-巨腦回畸形及癲癇發(fā)作患兒，首次發(fā)作主要表現為痙攣發(fā)作，后期部分可轉變?yōu)長ennox-Gastaut綜合征，強直陣攣發(fā)作多見，拉莫三嗪聯合丙戊酸治療的應答率超過85.0%，這種抗癲癇治療方法可能會減少癲癇發(fā)作的次數，從而提高這些患者的整體生活質量[4]。本組患兒中僅 1 例存在多種發(fā)作類型的患兒聯合使用了拉莫三嗪，加用拉莫三嗪后癲癇發(fā)作得到了有效控制，提示拉莫三嗪可以作為無腦回-巨腦回畸形合并難治性癲癇的藥物選擇，但因樣本過少，需要更多的研究證實。痙攣發(fā)作是本組患兒最常見的癲癇發(fā)作形式，與其他先前發(fā)表的無腦回-巨腦回畸形患者隊列數據一致[2]。按嬰兒痙攣的標準一線治療方案，即ACTH 和氨己烯酸，在本組無腦回-巨腦回畸形患兒中也有一定療效，這與其他研究結果一致[4-5]。此外，托吡酯是本組患兒中使用最多的藥物，無發(fā)作率和部分有效率均到達10%，高于丙戊酸、左乙拉西坦等其他常用的抗癲癇藥物，提示托吡酯也可作為此類難治性癲癇的藥物 選擇。

除藥物治療外，本組患兒中5 例還接受了根治性或姑息性癲癇手術治療，其中4例達到無發(fā)作，1例發(fā)作好轉。癲癇外科近年來發(fā)展迅速，但尚沒有廣泛開展，有研究建議藥物難治性癲癇患者都應在綜合性癲癇中心進行咨詢，使更多合適的患者能從癲癇手術中受益[6]。最近一項系統(tǒng)性綜述和薈萃分析的結果表明，癲癇手術應該是符合手術條件的局灶性藥物難治性癲癇兒童的首選治療方法[7]。本組患兒也表明了癲癇手術對無腦回-巨腦回患者的益處，藥物難治性癲癇患兒有條件均可接受癲癇術前評估，存在局灶性病灶可考慮根治性病灶切除術，廣泛性病灶可選擇姑息性手術如胼胝體切開術或者迷走神經刺激等。雖然癲癇手術在腦回畸形中的應用仍需要更大樣本量的研究，但可作為藥物難治性癲癇的治療選擇。

本組患兒中10 例僅有發(fā)育遲緩表型，提示對于發(fā)育遲緩的患兒，頭顱MRI 是尋找病因不可或缺的方法。本組患兒中未發(fā)現肌張力不全、震顫等運動障礙的表型，可能存在家屬未識別或發(fā)生率較低的 情況。

目前為止已經發(fā)現19 個無腦回-巨腦回相關基因，其中許多與微管結構蛋白或微管相關蛋白相關，這些基因包括PAFAH 1 B 1/LIS 1、DCX、ACTB、ACTG1、ARX、CDK5、CRADD、DYNC1H1、KIF2A、KIF 5 C、NDE 1/NDEL 1、TUBA 1 A、TUBA 8、TUBB、TUBB2B、TUBB3、TUBG1、RELN和VLDLR[8]。其中，PAFAH 1 B 1/LIS1和DCX是最常見的無腦回-巨腦回相關基因變異。

PAFAH1B1基因也被稱為LIS1基因，位于染色體17 p 13.3，參與細胞質動力蛋白介導的核分裂、胞體移位和細胞運動。PAFAH1B1基因變異相關的臨床表型有無腦回-巨腦回畸形、皮質下帶狀異位及Miller-Dieker綜合征，呈常染色體顯性遺傳[8-9]。PAFAH1B1基因變異相關的無腦回-巨腦回畸形大多伴難治性癲癇，癲癇發(fā)作常在1歲內起病，多表現為嬰兒痙攣癥，部分后期轉變?yōu)長ennox-Gastaut綜合征或不典型的癲癇綜合征，所有的PAFAH1B1/LIS1相關無腦回-巨腦回畸形患者都有嚴重的精神運動發(fā)育遲緩[4]。本組患兒中4例PAFAH1B1基因變異，臨床表型為廣泛或后頭部顯著的無腦回-巨腦回畸形、精神運動發(fā)育遲緩、難治性癲癇，其中2 例表現為嬰兒痙攣癥，與既往的報道基本一致[4]?；蛐?表型研究發(fā)現PAFAH1B1/LIS1基因變異常表現為后頭部更顯著的無腦回-巨腦回畸形[8]。本組4例PAFAH1B1基因變異患兒的頭顱MRI也表現這個特征。本組4例PAFAH1B1基因變異患兒的變異類型包括，2例剪接位點變異、1例無義變異及1例錯義變異，均為新發(fā)變異，已有文獻報道[10]。c.569-10 T＞C 變異位于第6 號內含子與第7 號外顯子的交界區(qū)域，目前已在多個無腦回畸形或皮質下帶狀異位患者中被檢出[11]；體內功能實驗證明該變異會影響mRNA 的正常剪切，導致7 號外顯子跳躍，定量分析顯示該變異產生的mRNA 豐度只有野生型的一半[12]。c.1002+1 G＞A 變異位于第9 號外顯子與內含子的交界區(qū)域，即剪接供體點，可能導致基因轉錄mRNA發(fā)生剪接異常。c.337C＞T變異為無義變異，可能導致該基因蛋白編碼的提前終止，其下游仍有多個無義變異致病的報道[10]，提示上述變異導致蛋白缺失部分對功能有重要影響。c.265C＞T錯義突變位于第5號外顯子，可能引起編碼蛋白的功能改變，但尚無相關功能學研究。

TUBA1A是主要的微管蛋白病變基因[13]。TUBA1A相關的微管病變是常染色體顯性遺傳病，主要由TUBA 1 A的新發(fā)變異引起，占所有無腦回-巨腦回畸形病例的5%[11]。TUBA 1 A相關的微管病變臨床表現多樣，主要神經影像學特征包括皮質旋轉異常、無腦回-巨腦回畸形和多小腦回，基底節(jié)、胼胝體、內囊和小腦也有異常，臨床特征包括全面性發(fā)育遲緩、小頭畸形、癲癇等。本組患兒中發(fā)現1 例TUBA 1 A基因c.1204C＞T錯義變異，引起R402C氨基酸改變，該位點是變異熱點，已有多項研究報道，并進行基因型-表型分析及功能研究[14-16]。研究發(fā)現，TUBA1A基因錯義突變最常受影響的氨基酸位于R402附近的C-末端區(qū)域，這些變異可導致R 402 的精氨酸替換為半胱氨酸（R402C）、組氨酸（R402H）、亮氨酸（R402L）或絲氨酸（R 402 S），R 402 殘基位于各種微管相關蛋白或馬達蛋白的相互作用位點，預測其會影響微管相關蛋白或馬達蛋白的結合[15]。R 402 位點變異占所有報告的TUBA1A變異的30.0%，體內、體外功能實驗均證明，該變異使微管蛋白異二聚體的產量降低，穩(wěn)定性下 降[16]。進一步研究證明，影響α-微管蛋白402位（R402）精氨酸的錯義變異，可選擇性損害動力蛋白的運動活性，并嚴重破壞皮質神經元的遷移[17]?；蛐?表型分析顯示，特定的基因型與某些臨床特征高度相關，其中R402C錯義變異患者大多表現為無腦回-巨腦回畸形、胼胝體發(fā)育不良、小腦發(fā)育不良[13,18]。本組患兒中的TUBA1A基因R402C變異患兒的頭顱MRI表現為無腦回-巨腦回及胼胝體發(fā)育不良，與既往報道相同，進一步證實TUBA 1 A基因R 402 C 變異具有高度相似的臨床表型。

綜上，無腦回-巨腦回畸形通常會導致嚴重的精神運動發(fā)育障礙和難治性癲癇，通常在出生一年內起病。痙攣發(fā)作患者可能從ACTH 或氨己烯酸中獲益，托吡酯對部分患者有效，癲癇手術也能改善發(fā)作及精神運動發(fā)育。對TUBA1A基因及PAFAH1B1/LIS1基因變異所致的巨腦回-無腦回患者的基因型-表型分析同既往的研究結果一致。但本組患兒的基因檢測陽性率低，提示病因可能為妊娠期環(huán)境因素或存在仍需探索的新致病基因。