糖尿病足患者皮膚微循環(huán)結(jié)構(gòu)及HIF-1α、VEGF表達(dá)水平的改變1

林楚佳，藍(lán)尤冕，歐妙瓊，鄞國書，楊曉平，林少達(dá)

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東 汕頭 515041）

糖尿病足病皮膚與正常皮膚相比具有典型組織學(xué)改變，真皮乳頭層內(nèi)血管數(shù)量明顯減少，影響創(chuàng)面的血供[1]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α）作為調(diào)控血管新生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)控下游基因血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF ）促進(jìn)微血管形成，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠創(chuàng)面HIF-1α及VEGF總體表達(dá)水平降低，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合過程血管形成不足[2]，因此推測(cè)HIF-1α及VEGF在人類糖尿病皮膚表達(dá)下降可能是糖尿病創(chuàng)面愈合延遲的原因之一。我們觀察30例糖尿病足潰瘍患者皮膚微循環(huán)結(jié)構(gòu)改變及真皮層HIF-1α、VEGF水平的改變，探討HIF-1α、VEGF水平改變?cè)谔悄虿∽銤冸y愈合以及修復(fù)過程中的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按符合1999年世界衛(wèi)生組織WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)并且足部出現(xiàn)潰瘍和/或深層組織破壞的入選標(biāo)準(zhǔn)，選擇2017年7月至2018年10月在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的30例糖尿病足病患者作為研究對(duì)象，其中男性16例，女性14例，平均年齡（62.36±10.82）歲，糖尿病病程96個(gè)月。本研究獲得醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均自愿參加并簽署知情同意書。同時(shí)入選因下肢外傷行外科手術(shù)治療的住院非糖尿病患者20例作為對(duì)照組，其中男性11例，女性9例，平均年齡（59.43±9.82）歲，從切除的多余皮膚中進(jìn)行取材。兩組患者性別、年齡差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 皮膚組織標(biāo)本的采集 糖尿病足組患者常規(guī)消毒后取傷口皮膚，使用無菌手術(shù)剪對(duì)糖尿病足病皮膚潰瘍邊緣皮膚組織進(jìn)行皮膚全層取材，大約0.5cm×1cm，去除皮下脂肪組織，一份立即放入4%多聚甲醛中固定，于48h內(nèi)制成蠟塊保存，用于免疫組化；另一份立即放入液氮中，并盡快放入-80℃冰箱保存，用于ELISA及熒光定量PCR。非糖尿病足對(duì)照組患者在外科手術(shù)過程中按手術(shù)需求切除多余皮膚并進(jìn)行皮膚取材。

1.2.2 免疫組化觀察皮膚微循環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及檢測(cè)皮膚HIF-1a、VEGF的表達(dá) HE染色對(duì)比兩組觀察對(duì)象皮膚真皮層組織結(jié)構(gòu)。通過免疫組化方法，用血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）標(biāo)記皮膚組織中的血管。200倍鏡下每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野進(jìn)行真皮乳頭內(nèi)微血管計(jì)數(shù)、測(cè)量真皮乳頭區(qū)域面積，計(jì)算微血管密度（微血管密度=微血管數(shù)÷乳頭層面積）。通過免疫組化方法對(duì)各組皮膚石蠟切片進(jìn)行HIF-1a、VEGF抗體染色，應(yīng)用Image pro plus 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行各指標(biāo)的量化分析，400倍鏡下每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野觀察皮膚表皮HIF-1a、真皮乳頭內(nèi)VEGF表達(dá)強(qiáng)度的平均光密度值。

1.2.3 ELISA檢測(cè)皮膚組織勻漿HIF-1α、VEGF水平 用ELISA雙抗夾心法，以特異性HIF-1α、VEGF單克隆抗體包被，酶聯(lián)特異性HIF-1α、VEGF多克隆抗體作為二抗檢測(cè)。操作嚴(yán)格按照試劑盒（英國R＆D Systems公司）說明書執(zhí)行。

1.2.4 熒 光 定 量PCR檢 測(cè) 皮 膚HIF-1α mRNA、VEGF mRNA水平 熒光定量PCR試劑和儀器：Tripure試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYB Green qRT-PCR Master Mix（Roche公 司，美 國）、DEPC（Sigma公司，美國）、低溫高速離心機(jī)及紫外分光光度儀（Eppendorf公司，德國）、CFX Connect熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad公司，德國）。引物基因序列采用NCBI自行設(shè)計(jì)，同時(shí)經(jīng)NCBIBLAST檢索無顯著同源性。取2-△△Ct代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚真皮層HE染色觀察及免疫組化觀察糖尿病足皮膚微循環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 皮膚HE染色見糖尿病足組皮膚基底膜變薄扁平，真皮乳頭面積增大，真皮膠原纖細(xì)、變性、斷裂，纖維束排列紊亂。CD31免疫組化觀察糖尿病足病組皮膚真皮乳頭密度（59.2±16.7）個(gè)/mm2比非糖尿病組（77.6±11.2）個(gè)/mm2下降（P=0.032）。糖尿病足病組皮膚真皮乳頭微血管密度（110.7±28.4）條/mm2比非糖尿病組（156.2±27.5）條/mm2下降（P=0.017）。見圖1。

圖1 非糖尿病組及糖尿病足病組皮膚真皮乳頭微血管密度（IHC×200）

2.2 皮膚HIF-1α、真皮層乳頭VEGF的表達(dá)強(qiáng)度HIF-1α蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。HIF-1α在非糖尿病皮膚表皮基底層細(xì)胞核呈陽性表達(dá)，而在糖尿病足病足皮膚表皮基底層表達(dá)明顯減弱。非糖尿病組皮膚表皮HIF-1α表達(dá)平均光密度值（0.28±0.07）明顯高于糖尿病足組（0.13±0.04），P=0.022。見圖2。非糖尿病組皮膚及糖尿病足組皮膚真皮層HIF-1α蛋白均呈陰性表達(dá)。

圖2 非糖尿病組及糖尿病足病組皮膚HIF-1α表達(dá)（IHC×400）

VEGF主要表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)金黃色顆粒，非糖尿病組皮膚表皮層真皮層細(xì)胞均有陽性表達(dá)，糖尿病足組皮膚表皮層真皮層VEGF表達(dá)減弱。非糖尿病組皮膚真皮乳頭內(nèi)VEGF表達(dá)平均光密度值（0.51±0.07）明顯高于糖尿病足組真皮乳頭內(nèi)VEGF表達(dá)光密度值（0.39±0.04），P=0.029。見圖3。

2.3 ELISA檢測(cè)皮膚真皮層組織勻漿HIF-1α、VEGF水平，熒光定量PCR檢測(cè)皮膚HIF-1α mRNA、VEGF mRNA水平，見表1。

3 討論

缺血缺氧誘導(dǎo)后新生血管生成障礙是糖尿病皮膚軟組織再生修復(fù)障礙的主要原因之一[3]。皮膚真皮乳頭層是真皮層與表皮層的物質(zhì)交換場(chǎng)所，微血管結(jié)構(gòu)及真皮乳頭生長狀態(tài)對(duì)傷口的愈合有重要影響。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病足皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，糖尿病足病組創(chuàng)口周圍皮膚真皮乳頭密度下降，真皮乳頭微血管密度比非糖尿病組下降，表明糖尿病足創(chuàng)面愈合過程血管形成不足。糖尿病足皮膚真皮乳頭層微循環(huán)結(jié)構(gòu)的改變與糖尿病足的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，血管新生障礙和/或延遲導(dǎo)致的缺氧缺血是糖尿病創(chuàng)面難以愈合的重要原因之一[4]。HIF-1α作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控的多種靶基因參與機(jī)體能量代謝、血管生成、細(xì)胞增殖和遷移、細(xì)胞凋亡等病理生理過程，在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮了重要作用[5]。在正常氧濃度條件下，HIF-1α被脯氨酸羥化酶羥化后降解；在缺氧條件下，HIF-1α不被降解而在細(xì)胞內(nèi)蓄

表1 皮膚組織勻漿HIF-1a、VEGF濃度及HIF-1α、VEGFmRNA表達(dá)水平 單位：ng/ml

積，通過核定位信號(hào)介導(dǎo)入細(xì)胞核激活下游基因表達(dá)，對(duì)機(jī)體內(nèi)的一系列因素進(jìn)行調(diào)節(jié)[6]。HIF-1α可通過調(diào)控下游基因包括VEGF等改善微血管病變。有研究表明，皮膚創(chuàng)傷后HIF-1α表達(dá)升高，進(jìn)而上調(diào)一系列成血管因子如VEGF的表達(dá)水平，觸發(fā)機(jī)體血管新生，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示非糖尿病皮膚表皮HIF-1a表達(dá)明顯高于糖尿病足皮膚表皮HIF-1α表達(dá)；非糖尿病皮膚真皮乳頭內(nèi)VEGF表達(dá)明顯高于糖尿病足真皮乳頭內(nèi)VEGF表達(dá)。ELISA檢測(cè)皮膚真皮層組織勻漿HIF-1α、VEGF水平，熒光定量PCR檢測(cè)皮膚HIF-1α、VEGFmRNA水平均提示糖尿病皮膚組織HIF-1α和VEGF在表達(dá)水平及其相關(guān)mRNA表達(dá)量較非糖尿病組下降。原因可能是高糖水平促進(jìn)超氧化物的增加，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)丙酮醛積累，從而減少HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)[8]。糖尿病足創(chuàng)口難愈合的主要因素可能是皮膚組織HIF-1α和VEGF表達(dá)的減少、微血管密度下降、血液供應(yīng)不足。

總之，HIF-1α及VEGF在糖尿病創(chuàng)口愈合中起到重要作用，其表達(dá)水平的下降導(dǎo)致新生血管的缺乏，并且延遲愈合過程。本次研究在治療糖尿病創(chuàng)口愈合中起到指導(dǎo)性意義，提示糖尿病足治療過程要關(guān)注皮膚微循環(huán)的改善。在未來，我們將會(huì)進(jìn)一步探索紅外治療技術(shù)是否能提高糖尿病足患者皮膚HIF-1α及VEGF的表達(dá)，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)口的愈合。