交泰丸治療失眠與口瘡的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制研究

王蔚陸楊若聰賈彩霞龐小涵陳與豐陳愉李思琪趙慧輝

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京100029

睡眠質(zhì)量下降常會影響人們的學(xué)習(xí)與工作，甚至?xí)又卦胁∏椋^發(fā)其他癥狀。美國一項(xiàng)衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)研究顯示，失眠患者消耗的醫(yī)療資源是非失眠患者的12倍［1］。Johnson以社區(qū)人群為研究對象，發(fā)現(xiàn)約30%的個(gè)體聲稱6～12個(gè)月內(nèi)有失眠經(jīng)歷［2］。世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球有將近7億失眠患者［3］。最新研究發(fā)現(xiàn)睡眠與炎癥免疫存在雙向聯(lián)系［4］。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是失眠患者最常出現(xiàn)的癥狀之一［5］，睡眠剝奪會延緩創(chuàng)面的愈合，口瘡引發(fā)的疼痛也會影響睡眠［6］。傳統(tǒng)治療基礎(chǔ)上加以適當(dāng)睡眠調(diào)節(jié)可促進(jìn)黏膜修復(fù)［7］。睡眠與黏膜損傷關(guān)系密切，二者致病機(jī)理有待進(jìn)一步探索。

中醫(yī)診療不僅著眼于病的異同，更著眼于機(jī)體的差異，辨證可發(fā)現(xiàn)心腎不交的不寐與陰虛火旺的口瘡均會出現(xiàn)潮熱盜汗，舌紅少苔，脈象細(xì)數(shù)等表現(xiàn)［8］，舌為心苗，心主神明，腎生髓，腦為髓海，足少陰經(jīng)循喉嚨夾舌本，絡(luò)氣別入膀胱經(jīng)，上榮腦髓，虛火內(nèi)生，上擾清竅是其病機(jī)，清心瀉火，引火歸元為其準(zhǔn)則。黃連降心火，肉桂鼓腎精，藥簡而力專。交泰丸組方實(shí)際源自明代醫(yī)易學(xué)家韓懋所著的《韓氏醫(yī)通·藥性裁成章》，其認(rèn)為肉桂一錢以應(yīng)“天一”，黃連六錢以應(yīng)“地六”，意在天一生水，地六承之。改否卦為泰，故名交泰，書中僅提交泰之名，直至清代王士雄在創(chuàng)作《四科簡效方》錄入安神諸方時(shí)，才把方名確定下來，用于治療怔忡不寐。近代醫(yī)家不僅用其治療傳統(tǒng)的失眠抑郁［9］，更用其治療糖尿?。?0］、非酒精性脂肪肝［11］、圍絕經(jīng)期綜合征［12］以及口腔潰瘍［13］等。本文借助近年來逐漸成熟的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)異病同治方法［14］探討其有效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 交泰丸成分靶點(diǎn)的篩選與獲取通過TCMSP（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）［15］和SymMap（https：//www.bioinfo.org/symmap.）［16］等數(shù)據(jù)庫尋找黃連與肉桂的成分，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行初篩以獲取有效成分及其靶點(diǎn)，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測到的信息。按服務(wù)器規(guī)定生成mol2格式文件，向SwissADME（http：//www。swissadme.ch/index.php）數(shù)據(jù)庫輸入上述文件計(jì)算小分子化合物理化性質(zhì)，以支持檢索發(fā)現(xiàn)。并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）規(guī)范靶點(diǎn)名稱，最后將中藥靶點(diǎn)取并集，得到交泰丸總的作用靶點(diǎn)。見表1。

1.2失眠和口瘡共有靶點(diǎn)的獲取分別向OMIM（http：//omim.org/，updatein 2018-07-03）、Gencards（http：//www.genecards.org/，version 4.8.0）、Drugbank（https：//www.Drug bank.ca/，version 5.1.1）輸入由Pubmed檢索得來的Mesh術(shù)語，獲得口瘡基因靶點(diǎn)與失眠基因靶點(diǎn)。將兩種疾病靶點(diǎn)取交集，就是失眠與口瘡的共有靶點(diǎn)。

1.3 方劑-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建把交泰丸總的作用靶點(diǎn)與口瘡與失眠的共有靶點(diǎn)再取交集，就是交泰丸治療口瘡與失眠可以共同起效的位點(diǎn)。將上述方劑、藥物成分、靶點(diǎn)與共有疾病作為節(jié)點(diǎn)，利用Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型。

1.4 共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析將交泰丸治療上述兩種疾病的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String（https：//string-db.org/，version10.5）數(shù)據(jù)庫中獲取蛋白相互作用關(guān)系，并用Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用MCODE算法進(jìn)行模塊分析，cytoHubba插件篩選核心靶點(diǎn)，并把核心靶點(diǎn)分別導(dǎo)入DisGeNET（http：//www.disgenet.org，version 5.0）數(shù)據(jù)庫中挖掘基因蛋白分類信息及其與疾病的聯(lián)系。最后使用Metascape（http：//metascape.org/，version 3.0）富集平臺，導(dǎo)入關(guān)鍵靶點(diǎn)，設(shè)置物種為人，進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，根據(jù)P值大小進(jìn)行排序，保留排名靠前的結(jié)果，借助bioinformatics平臺繪制高級富集分析氣泡圖。

1.5 構(gòu)建方劑成分-共病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖運(yùn)用CytoScape繪圖工具構(gòu)建交泰丸成分-共病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，分析Metascape富集分析參數(shù)，依據(jù)P值得到前15個(gè)核心通路，與上文遴選得到的活性成分靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，最終得到19個(gè)有效成分的69個(gè)基因靶點(diǎn)并制圖。

2 結(jié)果

2.1 交泰丸治療口瘡與失眠共同起效的作用靶點(diǎn)的獲取藥物方面，通過檢索TCMSP、Swisstarget等藥學(xué)數(shù)據(jù)平臺并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測的化合物靶點(diǎn)，結(jié)果顯示交泰丸中黃連有10個(gè)有效成分，355個(gè)靶點(diǎn)；肉桂有9個(gè)有效成分，183個(gè)靶點(diǎn)。兩味中藥搜索結(jié)果取并集，最終得到19個(gè)有效成分，456個(gè)靶點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，校正為官方名稱（official symbol）。

表1 交泰丸篩選得到的候選化合物

疾病方面，通過向OMIM、Gencards、Drugbank數(shù)據(jù)庫輸入由NCBI檢索得來的醫(yī)學(xué)專業(yè)術(shù)語insomnia進(jìn)行查詢，最終得到2622個(gè)失眠靶點(diǎn)。類似地通過向上述數(shù)據(jù)庫輸入Oral ulcer進(jìn)行查詢，可以得到4124個(gè)口瘡靶點(diǎn)，然后將兩種疾病的靶點(diǎn)取交集共得到813個(gè)共有靶點(diǎn)，就是導(dǎo)致兩種疾病發(fā)生的共有靶點(diǎn)，同樣，它也是藥物精準(zhǔn)治療的位點(diǎn)。

第三步，將方劑總的靶點(diǎn)與疾病共有靶點(diǎn)取交集，就是交泰丸治療以上兩種疾病可能顯效的位點(diǎn)，共有108個(gè)，創(chuàng)建思維導(dǎo)圖。見圖1。

圖1 獲取交泰丸“異病同治”關(guān)鍵靶點(diǎn)的思維導(dǎo)圖

圖2 交泰丸治療失眠和口瘡方劑-成分-靶點(diǎn)-共有疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.2 藥物-成分-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將108個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中構(gòu)建方劑-成分-靶點(diǎn)-共有疾病的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，合并簡化用于后續(xù)分析處理（圖2）。共涉及129個(gè)節(jié)點(diǎn)，386條邊。節(jié)點(diǎn)表示方劑、成分、靶點(diǎn)、共有疾病，邊表示節(jié)點(diǎn)彼此的聯(lián)系。形狀設(shè)置為圓，其中六邊形表示方劑、圓形表示黃連成分（10個(gè)）；V字形表示肉桂成分（9個(gè)）；菱形表示靶點(diǎn)（108個(gè)）；八邊形表示共有疾病。度值越大，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深越重要。根據(jù)Network Analyzer拓?fù)溥\(yùn)算結(jié)果，找出中心度值、親中心度值、等級值均值篩選后交集靶點(diǎn)較高的10個(gè)gene symbol（ACHE、BCHE、CHRM1、ADRA2C、PARP1、AR、CYP2D6、F3、ESR1、PTGS1）。

2.3 共有靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為進(jìn)一步了解共有靶點(diǎn)的相互關(guān)系。將靶點(diǎn)導(dǎo)入String中獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape繪制模型，節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示相互作用關(guān)系。節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，度值越大越重要（圖3）。網(wǎng)絡(luò)共涉及107個(gè)節(jié)點(diǎn)，848條邊，應(yīng)用MCODE算法識別密集連接組件，Cluster Finding參數(shù)設(shè)置為Haircut，degree cutoff：2，Node score Cutoff：0.2，K-Core：2，Max.Depth：100，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果涉及6大模塊（圖4），用字母顯示（K1，K2，K3，K4，K5，K6），最后根據(jù)度值用cytoHubba插件遴選出聯(lián)系最緊密的10個(gè)橫行霸道（AKT1、VEGFA、TLR4、ESR1、MMP9、DRD2、RELA、PIK3R1、MTOR、MAOA）。

圖3 交泰丸治療失眠和口瘡共有靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 共有靶點(diǎn)GO分析和KEGG通路分析將108個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入到Metascape生物注釋富集分析平臺中，設(shè)定物種為人，對其進(jìn)行基因本體分析和通路分析，發(fā)現(xiàn)基因靶點(diǎn)主要涉及一些神經(jīng)內(nèi)分泌遞質(zhì)有關(guān)的分子功能；作用場所為神經(jīng)突觸；血液循環(huán)、免疫炎癥與體內(nèi)激素的釋放是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的必要環(huán)節(jié)，通路分析發(fā)現(xiàn)cAMP、HIF-1和Ca2+信號，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE通路［17］與疾病的進(jìn)展聯(lián)系緊密。上海寶山［18］的一項(xiàng)口腔黏膜疾?。∣MD）與糖尿病抽樣調(diào)查，可以佐證神經(jīng)內(nèi)分泌的紊亂是消化道黏膜損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。對P值進(jìn)行排序，根據(jù)Analysis-Report保留數(shù)據(jù)，借助bioinformatics平臺繪制氣泡圖（圖5）。

圖4 交泰丸治療失眠和口瘡共有靶點(diǎn)蛋白相互作用模塊分析

2.5 交泰丸成分-共病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建運(yùn)用CytoScape構(gòu)建交泰丸成分-共病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。通過Metascape平臺，參照FINAL_GO文件中的P值，遴選前15個(gè)核心通路，然后與方劑有效活性成分靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，最終得到103個(gè)節(jié)點(diǎn)367條邊的網(wǎng)絡(luò)，基因節(jié)點(diǎn)均設(shè)置為圓形，肉桂成分為方形，黃連成分為三角形，通路為V字形；節(jié)點(diǎn)大小顏色透明度反映度數(shù)，節(jié)點(diǎn)越大顏色越深說明越重要。見圖6。

圖5 交泰丸治療失眠和口瘡共有靶點(diǎn)的KEGG通路分析、GO分析（細(xì)胞成分、分子功能與生物過程）的高級富集分析氣泡圖

表2 交泰丸治療失眠與口瘡的KEGG富集分析前15位通路

2.6 靶點(diǎn)蛋白歸屬與相關(guān)疾病將10個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DisGeNET中，獲取蛋白歸屬信息，結(jié)果顯示AKT1、PIK3R1、MTOR屬 激 酶，VEGFA與 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 有 關(guān)，ESR1為核受體，MMP9屬于酶，RELA屬轉(zhuǎn)錄因子，其余未明。檢索發(fā)現(xiàn)基因多與神經(jīng)、免疫、消化系統(tǒng)與內(nèi)分泌代謝疾病有關(guān)。AKT1與精神行為障礙有關(guān)（度值分?jǐn)?shù)0.9），VEGFA與皮膚和結(jié)締組織疾病有關(guān)（0.6），TLR4與糖尿病神經(jīng)病和克羅恩病有關(guān)（0.51、0.5），ESR1與乳房惡性腫瘤有關(guān)（1），MMP9與胃潰瘍有關(guān)（0.5），DRD2與情緒障礙精神抑郁有關(guān)（0.5），RELA與結(jié)腸炎有關(guān)（0.55），PIK3R1與胰島素抵抗有關(guān)（0.6），MTOR與局灶性Ⅱ型皮質(zhì)發(fā)育不良有關(guān)（0.74），MAOA與精神情緒有關(guān)（0.91），提示精神情志疾病，炎癥免疫介導(dǎo)的消化道黏膜損傷與以上基因相關(guān)。

3 討論

圖6 交泰丸成分-共有疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3.1 化合物與疾病通過檢索化合物來源數(shù)據(jù)庫檢索交泰丸化合物成分發(fā)現(xiàn)，α-松節(jié)烯與GABA-苯二氮卓（BZD）受體直接結(jié)合，延長GABA能突觸傳遞時(shí)程，在不影響非快動(dòng)眼睡眠（NREMS）質(zhì)量的情況下增強(qiáng)NREMS的數(shù)量，顯示出增強(qiáng)睡眠的特性［19］。1-環(huán)己基二乙酸單酰胺為加巴噴丁的中間體，加巴噴丁結(jié)構(gòu)與GABA類似，但不激動(dòng)受體，對病理興奮灶起到不同程度的抑制作用，快速恢復(fù)腦細(xì)胞的高級功能，維持神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，改善睡眠。棕櫚油酸可預(yù)防SHRSP大鼠因腦血管疾病引起的死亡，在給予1%棕櫚油酸的飲食后可顯著提高其存活率，并且在攝入過量NaCl的情況下，中風(fēng)發(fā)生率也不會升高，顯示出強(qiáng)大的腦血管保護(hù)作用［20］。此外，還可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸和單胺能通路來延緩動(dòng)物模型腸易激綜合征樣胃腸功能障礙的發(fā)展。通過促進(jìn)單胺氧化酶的氧化脫氨基，降低額前皮質(zhì)和杏仁核中的5-羥色胺含量，對自主神經(jīng)高級中樞和植物神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，減弱應(yīng)激誘導(dǎo)的去甲腎上腺素的變化，增強(qiáng)大腦區(qū)域的防御功能，從而達(dá)到改善睡眠、防治神經(jīng)衰弱的目的［21］。右旋龍腦極低劑量下即可對GABA受體Cl-電導(dǎo)產(chǎn)生高效的正調(diào)節(jié)作用，用于鎮(zhèn)痛和麻醉［22］。表小檗堿為膽堿酯酶抑制劑，對阿爾茨海默?。ˋD）有潛在治療作用［23］，一項(xiàng)有關(guān)睡眠調(diào)節(jié)與AD發(fā)病機(jī)制的研究表明，NREMS小幅增加可以改善小鼠模型中Aβ病理沉積從而緩解病情。黃藤素具有很強(qiáng)的吲哚胺-2，3-雙加氧酶（IDO）抑制活性。體內(nèi)研究可減少炎細(xì)胞浸潤，抑制結(jié)腸MPO活性，防治結(jié)腸炎小鼠模型腸黏膜損傷，預(yù)防腸道菌群失調(diào)和調(diào)節(jié)色氨酸分解代謝［24］。以上化合物可通過改善腦供血，保護(hù)腦細(xì)胞，抑制神經(jīng)沖動(dòng)，降低機(jī)體對應(yīng)激的敏感性，從而改善睡眠，患者只有心情舒暢，神經(jīng)內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)才能正常工作，炎癥介質(zhì)才可清除，黏膜潰瘍才會早日愈合。

3.2 基因與疾病基因既是疾病發(fā)生的原因，也是藥物作用的靶點(diǎn)，Hits欄中一些關(guān)鍵靶點(diǎn)，探討交泰丸起效的藥理機(jī)制。細(xì)胞色素P450酶系（CYP2D6）參與氧化多種化合物，如咖啡因的代謝，奧美拉唑硫氧化以及咪達(dá)唑侖的羥基化。劉要武等［25］認(rèn)為黃連瀉心火可能與降低尿兒茶酚胺有關(guān)，肉桂溫腎陽可能與提高尿17羥皮質(zhì)類固醇有關(guān)，測定以上指標(biāo)不僅可以檢測病情，同時(shí)也為心火亢盛，腎陽不足癥狀的治療提供了思路。對部分患者應(yīng)用交泰丸，以上指標(biāo)均趨于正常，癥狀明顯改善，可見該酶系可能在機(jī)體代謝方面發(fā)揮了重要作用。內(nèi)源性大麻素受體介導(dǎo)許多復(fù)雜反應(yīng)，包括飲食、記憶、焦慮、胃腸蠕動(dòng)、慢性疼痛等，可能與下丘腦線粒體呼吸調(diào)節(jié)有關(guān)。該受體天然合成阿片類成分，包括芬太尼、丁丙諾啡和美沙酮等。激動(dòng)劑與其結(jié)合可緩解焦慮抑郁的情緒，提高痛閾，改善睡眠［26］。AHR能調(diào)整生物鐘，恢復(fù)人體正常節(jié)律，有利于免疫調(diào)節(jié)與損傷修復(fù)［27］。RAB7B負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞中的TLR4信號傳導(dǎo)，與腦功能相關(guān)。NO介導(dǎo)冠狀血管中VEGF誘導(dǎo)的血管生成并可以改善腎小球的功能。ICAM蛋白是白細(xì)胞黏附蛋白LFA-1的配體，在白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移過程中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的組裝與炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，其中IL-26可能在黏膜免疫的局部機(jī)制中起作用。PTGS1在胃上皮細(xì)胞和牙周疾病中起細(xì)胞保護(hù)作用［28］。MMP2參與組織修復(fù)。MPO通過PMN誘發(fā)，生理情況下即可催化次氯酸生成，這些中間體顯著增強(qiáng)其殺菌活性。另有雌孕激素與消化道潰瘍相關(guān)性的流行病學(xué)報(bào)道顯示，女性患失眠與口瘡的概率高于男性［29］。以上靶點(diǎn)的分子機(jī)制均提示了交泰丸不僅可以緩解緊張情緒，改善睡眠，同時(shí)還可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素釋放，從而介導(dǎo)免疫炎癥促進(jìn)黏膜損傷修復(fù)。

3.3 AGE-RAGE信號通路與疾病糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路可激活多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號途徑，可增強(qiáng)NF-κB活性，介導(dǎo)炎癥因子IL-6及其受體亞基參與免疫調(diào)節(jié)和止痛信號的傳導(dǎo)［30］。在糖尿病神經(jīng)癥狀中，該通路加重了神經(jīng)系統(tǒng)功能的紊亂和對疼痛的敏感性。而與失眠、口瘡相關(guān)的多數(shù)靶點(diǎn)都有cAMP和Ca2+的參與，中醫(yī)主張辨證論治與治病求本，交泰丸有利于改善諸如cAMP參與調(diào)節(jié)的許多生物進(jìn)程，包括代謝、分泌、鈣穩(wěn)態(tài)等，最后是HIF-1信號通路與皮膚黏膜損傷有關(guān)，中藥成分針對以上風(fēng)險(xiǎn)起效，比如消腫止痛，調(diào)節(jié)免疫，修復(fù)傷口，從而促進(jìn)黏膜潰瘍愈合，改善睡眠質(zhì)量。

綜上所述，古人用交泰丸治療心腎不交的怔忡失眠，奉為圭臬，現(xiàn)將其應(yīng)用到消化道黏膜損傷的治療，收到良好的效果，這為方劑再開發(fā)提供了循證依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，交泰丸治療失眠和口瘡主要是通過改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血供，保護(hù)腦組織，調(diào)控突觸遞質(zhì)的釋放，從而減少不良刺激對機(jī)體的影響，使患者克服消極情緒，恢復(fù)神經(jīng)內(nèi)分泌的穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)免疫，清除炎性介質(zhì)，加速潰瘍愈合，方劑配伍不僅協(xié)同增效，而且能夠在抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的情況下，保留其抗炎活性，在達(dá)到治療疾病的同時(shí)，減少對機(jī)體的損傷。最后是通路基因靶點(diǎn)的高度擬合，提示其可能通過以上相似機(jī)制而顯效。由此可見，交泰丸通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路起到了異病同治的治療效果。