多重耐藥ST17無乳鏈球菌體外抗菌活性中藥篩選

程招敏， 潘敏旋， 柏彩英， 李亮， 李煒鑫， 周強， 柯培鋒

（1.廣東省中醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510120；2.廣東省婦幼保健院檢驗科，廣東廣州 510010；3.廣西中醫(yī)藥大學賽恩斯新醫(yī)藥學院，廣西南寧 530200）

無乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae）又稱為B群鏈球菌（GroupBstreptococcus，GBS），已成為引起侵襲性感染的重要條件致病菌[1]。通過多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）可將無乳鏈球菌分為不同的序列型（sequence typing，ST），不同ST菌株的耐藥性、致病性和毒力等方面存在差異。其中，ST17菌株被認為是高毒力菌株[2]，是引起各種侵襲性感染的主要無乳鏈球菌。研究[3]表明，ST17菌株的多重耐藥率越來越高且呈上升趨勢。本研究擬從74種常用的中藥顆粒中，篩選對多重耐藥ST17無乳鏈球菌具有抑菌作用的中藥，為其引起感染的防控提供新的途徑，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株本研究中的無乳鏈球菌均為非重復菌株，分離于2018—2020年間就診于廣東省中醫(yī)院的患者的血液、腦脊液、中段尿、肺泡灌洗液和腹水等標本。質(zhì)控株肺炎鏈球菌ATCC49619和大腸埃希菌ATCC8739均購于美國典型菌種保藏中心。

1.2中藥本試驗中的74種中藥配方顆粒，均購自廣東一方制藥有限公司，包括黃芩、黃柏、黃連、大黃、麻黃、木香、雞血藤、淡附片、細辛、姜黃、薄荷、仙鶴草、側柏葉、金銀花、夏枯草、白芷、白芍、赤芍、苦參、柴胡（北）、甘草、艾葉、枳實、炒蒼耳子、連翹、淫羊藿、白前、桑白皮、桔梗、紫草、熟地黃、檳榔、杜仲、梔子、知母、山楂、女貞子、烏梅、牛膝、荊芥、廣藿香、莪術、延胡索、牡丹皮、槐花、丹參、醋香附、淡竹葉、麥冬、蒲公英、肉蓯蓉、北沙參、補骨脂、防風、苦杏仁、巴戟天、豬苓、地榆、生地黃、黨參、瓜蔞皮、黃芪、白花蛇舌草、青蒿、蒼術、板藍根、蘆根、金櫻子、白茅根、五味子、川芎、魚腥草、龍膽、土茯苓。

1.3試劑與儀器水解酪蛋白（M-H）血平板、哥倫比亞血平板和M-H肉湯（廣州迪景公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒和Premix Taq（大連TaKaRa公司）；藥敏紙片及抗生素干粉（英國Oxoid公司）；MLST分型所需引物由上海生工公司合成；Costar 96孔板（美國康寧公司）；VITEK MS質(zhì)譜儀及配套檢測試劑（法國梅里埃公司）；聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀（美國ABI公司）。

1.4試驗方法

1.4.1 ST17無乳鏈球菌的篩選 收集的127株無乳鏈球菌復蘇后，參照Cheng等[4]報道，采用VITEK MS質(zhì)譜儀RUO模式進行質(zhì)譜峰的收集，在7 620 Da處有特征質(zhì)譜峰的菌株為ST17無乳鏈球菌的備選菌株。以大腸埃希菌ATCC8739為質(zhì)譜鑒定的質(zhì)控株。參照Jones等[5]建立的方法進行MLST分型，采用PCR技術擴增備選菌株的7個管家基因（adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcK和tkt），擴增產(chǎn)物送至上海生工公司進行測序分析，對備選菌株的ST進行確認。

1.4.2 多重耐藥ST17的篩選 采用K-B法，檢測各ST17菌株對青霉素（10 units）、紅霉素（15μg）、克林霉素（2μg）、四環(huán)素（30μg）、左氧氟沙星（5μg）、氯霉素（30μg）、利奈唑胺（30μg）、萬古霉素（30μg）等8種抗菌藥物的敏感性，操作步驟和藥敏結果判斷參照2020年版臨床和實驗室標準化協(xié)會（clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗菌藥物敏感試驗指南（http：//www.clsi.org）的試驗要求。藥敏試驗以肺炎鏈球菌ATCC49619為質(zhì)控株。

1.4.3 藥液的配制 根據(jù)各中藥配方顆粒相當于原藥的質(zhì)量，將74種藥物分別溶解制成相當于原藥濃度為1 g·mL-1的藥液，高壓滅菌后保存于4℃冰箱中備用。

1.4.4 具有抑菌活性中藥顆粒的篩選 將復蘇后的試驗菌株，均配制成0.5麥氏濃度的菌懸液，涂布于M-H血平板上。用孔徑為6 mm的打孔器在涂布有菌液的平板上打孔，向孔中加入100μL的待篩選藥物，將平板置于35℃、5%CO2孵箱中孵育18 h。根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷抑菌效果，判斷標準：抑菌圈直徑＜10 mm為無抑菌作用；10 mm≤抑菌圈直徑＜15 mm為弱抑菌作用；15 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm為中等抑菌作用；抑菌圈直徑≥20 mm為強抑菌作用[6]。

1.4.5 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定 采用宏量肉湯稀釋法，參照《抗菌藥物敏感性試驗的技術要求》（WS/T689-2018）文件中的方法，檢測有中等以上抑菌活性的各藥液的MIC和MBC。方法：結合預實驗的結果，配制初始濃度為512 mg·mL-1的藥液，逐步對倍稀釋至濃度為0.125 mg·mL-1，共13個濃度菌液。以肉眼可見抑制細菌生長的最低濃度為MIC。將高于MIC的相鄰的3個濃度的菌液，分別取100μL轉種到血平板上，于35℃、5%CO2孵箱中孵育18 h，與生長對照管相比，殺滅99.9%以上細菌生長的最低濃度為MBC。

1.4.6 中藥與紅霉素或克林霉素的相互作用

1.4.6.1 宏量肉湯稀釋法 采用宏量肉湯稀釋法，參照“1.4.5”項中的操作步驟，結合各菌株對紅霉素和克林霉素的實際藥敏情況，配制512μg·mL-1的藥液，依次對倍稀釋至濃度為0.125μg·mL-1，檢測各菌株的紅霉素和克林霉素的MIC。

1.4.6.2 棋盤稀釋法 采用棋盤稀釋法，檢測“1.4.5”項中各中藥分別與紅霉素或克林霉素兩兩聯(lián)合的抑菌效果。操作步驟參照本課題組前期報道[6]。

1.4.6.3 分級抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)法 采用FIC指數(shù)判斷兩兩聯(lián)合抑菌效果。FIC指數(shù)計算公式：FIC=A聯(lián)用MIC/A單獨MIC+B聯(lián)用MIC/B單獨MIC；FIC≤0.5，協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1，相加作用；1＜FIC≤2，無關作用；＞2，拮抗作用[6]。

1.5統(tǒng)計方法抗生素藥敏結果采用WHONET 5.6軟件進行統(tǒng)計分析。采用SPSS 22.0軟件對中藥抑菌圈直徑進行統(tǒng)計學分析，計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ST17無乳鏈球菌的篩選結果127株無乳鏈球菌經(jīng)VITEK MS質(zhì)譜儀RUO模式進行鑒定后，共有20株在7 620 Da處有特征質(zhì)譜峰，如圖1所示。20株ST經(jīng)MLST分型最終19株確定為ST17菌株，ST17菌株檢出率為15.0%（19/127）。

圖1 ST17無乳鏈球菌與非ST無乳鏈球菌質(zhì)譜圖的比較Figure 1 Comparison of mass spectrograms of Streptococcus agalactiae ST17 strains and non-ST17 strains

2.2多重耐藥ST17無乳鏈球菌的篩選結果所有ST17菌株對青霉素、萬古霉素和利奈唑胺均敏感（敏感率均為100.0%），對四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素的耐藥率分別為100.0%（19/19）、89.5%（17/19）、89.5%（17/19）、26.3%（5/19）、5.3%（1/19）。本次共篩選出17株多重耐藥ST17菌株，即多重耐藥率為89.5%（17/19）。

2.3具有抑菌活性中藥顆粒的篩選結果如表1所示，共篩選出18種對17株試驗菌株均有抑菌作用的中藥，其中：黃柏、黃連和桑白皮具有強抑菌作用；甘草、五味子、大黃、雞血藤和地榆具有中等抑菌作用；連翹、黃芩、麻黃、白芷、赤芍、檳榔、艾葉、仙鶴草、烏梅和夏枯草的抑菌作用較弱。

表1 18種中藥對多重耐藥ST17無乳鏈球菌的抑菌效果Table 1 Comparison of the bacteriostatic effects of 18 kinds of Chinese herbal medicine against multi-resistant Streptococcus agalactiae ST17 strains

2.4 MIC和MBC測定本次共測定了8種具有中等以上抑菌活性的中藥配方顆粒的MIC和MBC，其中：所有試驗菌株對黃柏、黃連、桑白皮、甘草、大黃、雞血藤和地榆的MIC依次為2、0.512、1、16、8、8、8 mg·mL-1；23.5%（4/17）的試驗菌株對五味子的MIC為64 mg·mL-1，76.5%（13/17）為32 mg·mL-1。所有試驗菌株對黃柏、黃連、桑白皮、甘草、大黃和五味子的MBC依次為8、1、8、32、32、64 mg·mL-1；35.3%（6/17）的試驗菌株對雞血藤的MBC為16 mg·mL-1，64.7%（11/17）為32 mg·mL-1；11.8%（2/17）的試驗菌株對地榆的MBC為16 mg·mL-1，88.2%（15/17）為32 mg·mL-1。

2.5中藥與紅霉素或克林霉素的相互作用41.2%（7/17）的試驗菌株對紅霉素MIC為8μg·mL-1，47.1%（8/17）為4μg·mL-1，5.9%（1/17）為2μg·mL-1、5.9%（1/17）為0.25μg·mL-1；23.5%（4/17）的試驗菌株對克林霉素MIC為16μg·mL-1，70.6%（12/17）為8μg·mL-1，5.9%（1/17）為0.25μg·mL-1。除黃連外，其他7種有中等以上抑菌活性的中藥與紅霉素或克林霉素均為無關作用（1＜FIC≤2）。如表2和表3所示，對于紅霉素或克林霉素耐藥菌株，黃連與紅霉素或克林霉素聯(lián)合用藥的FIC≤0.5，而對于敏感株聯(lián)合用藥時1＜FIC≤2。

表2 黃連和紅霉素聯(lián)合使用對多重耐藥ST17無乳鏈球菌的抑菌效果Table 2 Comparison of the bacteriostatic effects of combination of Coptidis Rhizoma with erythromycin against multi-resistant Streptococcus agalactiae ST17 strains

表3 黃連和克林霉素聯(lián)合使用對多重耐藥ST17無乳鏈球菌的抑菌效果Table 3 Comparison of the bacteriostatic effects of combination of Coptidis Rhizoma with clindamycin against multi-resistant Streptococcus agalactiae ST17 strains

3 討論

ST17無乳鏈球菌被認為是“高毒力”菌株[7]，是引起各種侵襲性感染的主要無乳鏈球菌。該ST菌株已成為廣州地區(qū)流行的主要侵襲性無乳鏈球菌之一[8]。本研究中，臨床分離株ST17占15.0%，這與有關報道[8]的廣州地區(qū)結果相似。本研究參照課題組前期建立的方法[4]，通過特征質(zhì)譜峰鑒定ST17菌株，但經(jīng)MLST確認有1株并非ST17菌株，這說明在該地區(qū)流行的ST中，還有其他ST在7 620 Da處有特征質(zhì)譜峰。鑒于ST17是該地區(qū)流行的主要ST，且質(zhì)譜鑒定成本低、通量高、操作簡單，質(zhì)譜鑒定仍然適用于該地區(qū)ST17菌株的快速篩查。

侵襲性ST17菌株的多重耐藥率越來越高。本研究中ST17菌株的多重耐藥率高達89.5%，這與相關報道[4，9]相似。對于青霉素過敏的患者，紅霉素和克林霉素是無乳鏈球菌引起感染治療的重要替代藥物，然而，ST17無乳鏈球菌對紅霉素和克林霉素的耐藥率不斷升高[10]。鑒于以上情況，尋找新的抗菌藥物對解決多重耐藥ST17菌株引起的感染至關重要。研究[6，11]表明，部分中藥對多重耐藥菌具有良好的抗菌活性。此外，中藥具有耐藥性危害低和毒副作用小等優(yōu)點。因此，從中藥中尤其是直接從臨床常用的配方顆粒中篩選多重耐藥菌株的抑制劑具有廣泛的前景和臨床價值。

本研究中的74種中藥，有56種對多重耐藥ST17菌株無體外抑菌活性，但部分無抑菌活性的中藥，如蒲公英[12]、黃芪[13]和廣藿香[11]等，對部分其他病原菌具有較好的抗菌活性。這表明同種中藥抗菌活性因細菌種類不同而存在差異。此外，有研究表明，金銀花[14]、蒲公英[14]、板藍根[14]、槐花[15]和側柏葉[15]對羅非魚源性無乳鏈球菌有較好的體外抗菌活性，而魚源性無乳鏈球菌主要ST分布和人源性菌株存在明顯差異[16]，我們據(jù)此推測不同ST無乳鏈球菌對同種中藥的敏感性可能存在差異，但這需要進一步研究。本研究篩選出的18種有抑菌活性的中藥，均被報道對部分其他細菌有抑菌作用[6，17-18]，但鑒于連翹、黃芩、麻黃、白芷、赤芍、檳榔、艾葉、仙鶴草、烏梅和夏枯草等10種中藥對試驗菌株的抑菌活性較弱，又由于本研究是直接從配方顆粒中篩選中藥抑制劑而非中藥單體成分，為了保證篩選出的顆粒劑對多重耐藥菌株有較好抑菌效果，故我們只檢測有中等以上抑菌活性中藥顆粒劑的MIC和MBC。通過宏量肉湯稀釋法檢測8種中藥顆粒劑的MIC值顯示，黃連、黃柏和桑白皮的體外抑菌活性較強，而大黃、雞血藤、地榆、甘草和五味子相對較弱，這與瓊脂打孔法的結果較一致。有研究表明，黃連水提物[19]（MIC和MBC分別為3.125 mg·mL-1和6.250 mg·mL-1）、雞血藤水提物[14]（MIC為62.5 mg·mL-1）、桑白皮乙醇提取物[15]（MIC和MBC均為0.390 6 mg·mL-1）對羅非魚源性無乳鏈球菌也有抑菌作用，但這些藥物的MIC和MBC與本研究存在一定的差異。這可能一方面是由于菌株來源不同，另一方面上述研究采用的均是中藥材提取物，而本研究采用的中藥配方顆粒劑，可能兩者的有效成分含量存在差異。這也表明，如果要建立某種細菌有體外抑菌活性中藥的敏感性折點，需要納入不同來源的菌株進行大樣本研究，且需要對試驗中藥有效成分的含量進行標準化。

本研究結果顯示，對于紅霉素或克林霉素耐藥株，黃連分別與紅霉素或克林霉素聯(lián)合用藥均出現(xiàn)協(xié)同作用（FIC均≤0.5），但對于紅霉素或克林霉素敏感株，聯(lián)合用藥均表現(xiàn)為無關作用（1＜FIC≤2）。有研究表明，黃連抑菌的主要有效成分為小檗堿、黃連堿和藥根堿[20]，其中小檗堿還使黃連有R耐藥質(zhì)粒消除作用，可逆轉細菌對抗生素的耐藥性[21]。但無乳鏈球菌對紅霉素和克林霉素耐藥主要由ermB、ermTR、mefA/E和linB基因[22]介導而非質(zhì)粒介導。因此，R耐藥質(zhì)粒消除并不能解釋黃連與紅霉素或克林霉素聯(lián)用時，對紅霉素或克林霉素耐藥的菌株出現(xiàn)協(xié)同作用而對其敏感的菌株則為無關作用這一現(xiàn)象。

此外，本研究的樣本量有限，針對上述現(xiàn)象，需要擴大樣本量進一步研究。