基于代謝組學(xué)分析腎虛督寒型強(qiáng)直性脊柱炎代謝網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)

梁偉東， 彭劍虹， 尹曉霞， 葉雪英， 陳少敬

（東莞市中醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東東莞 523200）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種以累及中軸關(guān)節(jié)為主，以骶骼關(guān)節(jié)和脊柱附著點(diǎn)炎癥為主要癥狀的疾病，表現(xiàn)為脊柱疼痛、僵直等不適，并逐漸出現(xiàn)脊柱畸形，最終可導(dǎo)致殘疾，使人失去生活自理能力，從而給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。AS的發(fā)病人群多以青少年男性為主，發(fā)病原因尚未明確，可能與人類白細(xì)胞表面抗原B27（HLA-B27）及遺傳相關(guān)，并受后天環(huán)境影響[3]。臨床發(fā)現(xiàn)，本病往往伴隨怕冷、四肢冰冷、夢(mèng)中流涎等一系列腎虛表現(xiàn)，西醫(yī)難以解釋其伴隨癥狀的產(chǎn)生機(jī)制且對(duì)其處理效果欠佳。本病屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“大僂”范疇，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其病機(jī)為腎虛督寒，并且證實(shí)在此病機(jī)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上采用中醫(yī)藥治療具有明顯優(yōu)勢(shì)。但由于認(rèn)識(shí)上存在一定的主觀性，以及辨證分型的不統(tǒng)一，從而影響了其在臨床的有效推廣應(yīng)用。

代謝組學(xué)是一門對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，研究生物體在不同狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)代謝物變化的學(xué)科，通過(guò)結(jié)合證候研究，以尋找該變化與證候特征的內(nèi)在聯(lián)系，從而揭示機(jī)體生命活動(dòng)的代謝本質(zhì)[4]?；诖?，本研究創(chuàng)新性收集腎虛督寒型AS患者證候樣本并結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)行代謝產(chǎn)物譜分析，從代謝網(wǎng)絡(luò)水平揭示AS與證候變化的內(nèi)在聯(lián)系，為下一步研究和尋找中藥的作用靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象收集2019年1月至2019年10月在東莞市中醫(yī)院門診或住院部接受治療的25例腎虛督寒型AS患者作為AS組；另外，收集同期來(lái)自東莞市中醫(yī)院體檢中心的健康受試者25例作為對(duì)照組（健康組）。本研究已通過(guò)東莞市中醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查，并且所有受試者均簽署了知情同意書(shū)。

1.2病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)直性脊柱炎的診斷參照1984年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：參照國(guó)家中醫(yī)藥管理“十一五”重點(diǎn)?？茀f(xié)作組制定的《大僂（強(qiáng)直性脊柱炎）診療方案》中關(guān)于腎虛督寒型的中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合強(qiáng)直性脊柱炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合腎虛督寒型的中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；③年齡介于16～60歲的患者。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①妊娠期或哺乳期婦女；②年齡小于16歲或大于60歲者；③合并有糖尿病、冠心病、腎功能不全等基礎(chǔ)疾病的患者；④同時(shí)患有其他風(fēng)濕免疫性關(guān)節(jié)炎如白塞氏病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎的患者；⑤合并有感染等急性并發(fā)癥的患者。

1.3試劑與儀器

1.3.1 試劑 無(wú)水磷酸二氫鈉（NaH2PO4）來(lái)自廣州廣試儀器有限公司，二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·2H2O）來(lái)自粵僑有限公司，重水（D2O）來(lái)自杭普實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)儀器 超導(dǎo)核磁共振波譜儀（Varian NMR System 500MHz，美國(guó)瓦里安有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀BS-220（邁瑞，武漢盛世達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司）；微孔板振蕩器（無(wú)錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司）；核磁管（寧杭普實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.4研究?jī)?nèi)容分析AS組與健康組血漿中代謝物差異，并配合分析2組受試者的中醫(yī)證候分布情況（主證包括腰痛、晨僵，次證包括惡寒怕冷、四肢不溫、夢(mèng)中流涎、大便不調(diào)）及血沉（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等各項(xiàng)炎癥指標(biāo)的不同，以闡述腎虛督寒型AS的代謝特征和病理機(jī)制。

1.5研究方法

1.5.1 樣品預(yù)處理 分別抽取AS患者及健康受試者血樣6 mL，在4℃、頻率為10 000 Hz下離心10 min，吸取上層血清300μL至核磁管中，加入0.2 mol/L磷酸平衡液（pH=7.4）200μL和重水50μL，振蕩混勻。

1.5.2 核磁共振氫譜（1H-NMR）的測(cè)定分析 在25℃條件下，設(shè)置脈沖序列為Carr-Purcell-Mei boom-Gill，譜寬為10 000 Hz，回波時(shí)間為1 ms，進(jìn)行64 k采樣點(diǎn)數(shù)，64次循環(huán)次數(shù)，128次疊加次數(shù)核磁掃描。核磁信號(hào)經(jīng)過(guò)傅立葉變換轉(zhuǎn)為圖譜。

1.5.3 圖譜處理 使用專業(yè)軟件MestReNova（version 8.0.1）進(jìn)行圖譜分析，把乳酸峰（δ1.33）作為化學(xué)位移參考峰，對(duì)所得圖譜進(jìn)行相位、基線調(diào)整并自動(dòng)積分，其區(qū)域規(guī)定為δ0.5～9.0，以0.005 ppm為積分間隔。消除δ4.7～5.1區(qū)域水峰（積分值設(shè)為零），將所得積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化處理，以Excel形式保存，進(jìn)行下一步多元化統(tǒng)計(jì)。

1.6數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析把上述積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P14.0軟件（Umetrics，瑞典）進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。作為評(píng)估模型驗(yàn)證參數(shù)的R2和Q2，大于50%提示模型統(tǒng)計(jì)有效。OPLS-DA結(jié)果使用得分圖（score plot）和載荷圖（loading plot）的形式表示。通過(guò)分析得分圖中組間積分差異化學(xué)位移，在載荷圖找出對(duì)這種差異的貢獻(xiàn)值，并結(jié)合一維NMR譜圖峰值變化，尋找相對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物。其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者基線資料比較AS組25例受試者中，男14例（占56.0%），女11例（占44.0%）；平均年齡（31.64±4.23）歲。健康組25例受試者中，男14例（占56.0%），女11例（占44.0%）；平均年齡（30.91±3.87）歲。2組受試者的性別、年齡等基線資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 2組受試者證候分布情況比較表1結(jié)果顯示：AS組的腰痛、晨僵等主癥及惡寒怕冷、四肢不溫、夢(mèng)中流涎、大便不調(diào)等次癥的分布頻率均明顯高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 2組受試者的證候分布情況比較Table 1 Distribution of the syndrome manifestations in the two groups [例（%）]

2.3 2組受試者各項(xiàng)炎癥指標(biāo)比較表2結(jié)果顯示：AS組的CRP、ESR、IL-6和TNF-α水平均明顯高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示AS患者處于炎癥活動(dòng)期。

表2 2組受試者各項(xiàng)炎癥指標(biāo)比較Table 2 Comparison of the levels of inflammatory indicators in the two groups （x±s）

2.4 2組受試者血漿中代謝物差異分析

2.4.1 2組受試者血漿中代謝物的1H-NMR分析 結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)觀察健康組和AS組血漿中代謝物的1H-NMR分析圖譜（化學(xué)位移區(qū)間δ0.5～9，放大8倍）的差異，并結(jié)合COSY、TOCSY、HSQC等數(shù)據(jù)庫(kù)[5-8]，對(duì)2組受試者存在差異的代謝物進(jìn)行峰值歸屬，并查找其對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14種代謝產(chǎn)物可在肉眼下被區(qū)分，對(duì)于差異較少的代謝物，需要進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)，以進(jìn)一步挖掘存在差異的代謝產(chǎn)物。

圖1 強(qiáng)直性脊柱炎（AS）組和健康組血漿中代謝物的1H-NMR分析結(jié)果Figure 1 1H-NMR analysis results for the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

2.4.2 2組受試者血漿中代謝物的非監(jiān)督PCA分析 對(duì)健康組與AS組的代謝物進(jìn)行非監(jiān)督PCA分析。由圖2可見(jiàn)，由于健康志愿者處于相對(duì)穩(wěn)定代謝狀態(tài)，故分布相對(duì)集中，在組間差異中，2組基本能區(qū)分開(kāi)，但仍有部分重疊（PC1vs.PC2，R2=88.8%，Q2=71.1%），提示模式良好。為取得更有意義統(tǒng)計(jì)結(jié)果，故進(jìn)一步行PLS-DA和OPLSDA分析。

圖2 強(qiáng)直性脊柱炎（AS）組和健康組血漿中代謝物的PCA分析圖Figure 2 PCA analysis results for the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

2.4.3 2組受試者血漿中代謝物1H-NMR的PLSDA和OPLS-DA分析 進(jìn)一步行PLS-DA分析，結(jié)果如圖3[R2x=80.6%，R2y=90.1%，Q2（cum）=82.7%]。由得分圖可以看出，2組的組間分布得到完全分開(kāi)，但組內(nèi)存在個(gè)別樣本分布相對(duì)分散。為尋找與發(fā)病機(jī)制及證型相關(guān)的代謝物，再次進(jìn)行OPLS-DA分析，以提高模式識(shí)別方法的判定能力，得到結(jié)果如圖4-a[R2x=83.9%，R2y=91.9%，Q2（cum）=88.4%]。從圖中可以看出，組間無(wú)交叉和重疊，且2組各自集中分布，表明其模式是有效的。進(jìn)一步行組間OPLS-DA結(jié)果的載荷圖分析（圖4-b），取權(quán)重系數(shù)（VIP）＞1，發(fā)現(xiàn)94個(gè)差異變量，結(jié)合實(shí)際圖譜，篩選出其中的19個(gè)代謝物，分別為HDL-C、異白氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脂類化合物、N-乙酰天冬酰胺、谷氨酸鹽、α-酮戊二酸、甘氨酸、馬尿酸鹽、酪氨酸、苯丙氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺、脯氨酸、纈氨酸、膽 堿、精氨酸、蘇氨酸。

圖3 強(qiáng)直性脊柱炎（AS）組和健康組血漿中代謝物1H-NMR的PLS-DA分析圖Figure 3 PLS-DA graph of 1H-NMR analysis results for the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

圖4 強(qiáng)直性脊柱炎（AS）組和健康組血漿中代謝物1H-NMR的OPLS-DA分析得分圖（a）與載荷圖（b）Figure 4 OPLS-DA graph score plot（a）and loading plot（b）of 1H-NMR analysis results for the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

為了更直觀地表示代謝物變化趨勢(shì)及其貢獻(xiàn)，采用建立coefficient-loading相關(guān)圖的形式來(lái)表現(xiàn)代謝物的變化，運(yùn)用back-scaling的數(shù)據(jù)處理模式，得到的圖譜為NMR圖譜的形狀[9]。結(jié)果見(jiàn)圖5和表3。由于把健康組作為參考組進(jìn)行對(duì)比，故圖中向上的代謝峰說(shuō)明AS患者的代謝物水平下降，而向下的代謝峰則說(shuō)明AS患者的代謝物水平上升。從圖中的顏色分布可知，顏色越紅表示貢獻(xiàn)率越大，即相應(yīng)的代謝物在2組之間的差異越顯著；顏色越藍(lán)表示貢獻(xiàn)率越小，即相應(yīng)的代謝物在2組之間的差異越不顯著。由于本研究的研究人數(shù)為50例，查閱相關(guān)系界值數(shù)表，可以得出其相關(guān)系數(shù)臨界值︱r︱?yàn)?.556，表示如果代謝物的相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值大于0.556，即可說(shuō)明該代謝物的變化具有顯著性差異。從表3結(jié)果可以看出，與健康組相比，AS組中的HDL-C、異白氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、N-乙酰天冬酰胺、脂類化合物、谷氨酸鹽、α-酮戊二酸、甘氨酸、肌醇、馬尿酸鹽及酪氨酸水平上升，而膽堿、丙氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺、脯氨酸、纈氨酸、二甲胺、精氨酸、蘇氨酸的水平下降。

圖5 強(qiáng)直性脊柱炎（AS）組和健康組代謝產(chǎn)物差異對(duì)比圖Figure 5 Differences in the plasma metabolites in the AS group and healthy controlgroup

表3 2組受試者差異代謝產(chǎn)物的名稱及變化趨勢(shì)Table 3 The differentialmetabolites and their variation trend in the AS group and healthy controlgroup

2.5潛在代謝通路分析通過(guò)分析代謝物的變化能夠更好地體現(xiàn)人體代謝信息網(wǎng)絡(luò)，尋找異常代謝通路。把篩選出來(lái)的19種代謝輸入MetaboAnalyst 4.0進(jìn)行分析，綜合HolmP值、FDR（false discovery rate）值和Impact值，共發(fā)現(xiàn)多條重要的代謝通路，其中前8條Pathway Impact＞0.1，被列為最主要的代謝途徑（圖6），它們分別為酪氨酸通路、甘氨酸-蘇氨酸代謝通路、苯丙氨酸通路、酮體通路、β-丙氨酸通路、丙酮酸通路、氨酰tRNA生物合成、乙醛酸和二元酸通路。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，涉及到的代謝通路包括能量代謝、葡萄糖代謝、氨基酸代謝、脂類代謝以及胃腸道菌群及免疫紊亂，其從多方面影響脾-腎軸功能，從而形成腎虛督寒基本病機(jī)（圖7）。

圖6 強(qiáng)直性脊柱炎（AS）患者代謝網(wǎng)絡(luò)分析圖Figure 6 Metabolic network analysis for the AS patients

圖7 強(qiáng)直性脊柱炎（AS）患者腎虛督寒機(jī)制代謝通路分析圖Figure 7 Analysis of the pathway of the metabolites in the AS patients with the syndrome of deficiency of kidney and cold of governor vessel

3 討論

強(qiáng)直性脊柱炎（AS）屬于中醫(yī)學(xué)“大僂”“腰痛”等范疇，大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本病與腎有關(guān)?！睹}要精微論》曰：“腰者腎之府，轉(zhuǎn)搖不能，腎將憊矣。”《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》曰：“凡人之腰疼，皆脊梁處作疼，此實(shí)督脈主之……腎虛者，其督脈必虛，是以腰疼?！睆堝a純認(rèn)為，脊髓袋，即尾閭關(guān)，其位于督脈，卻源自命門，連接任脈，任脈屬陰，督脈屬陽(yáng)，是孕育精氣，封藏元?dú)獾牡胤?。由于本虛邪勝，元?dú)馐в跐摬?，督脈失養(yǎng)而生本病。全國(guó)名老中醫(yī)王慶國(guó)教授認(rèn)為，本病以腎虛督脈失養(yǎng)為本，寒濕、熱瘀等為標(biāo)，邪阻督脈，氣血虧虛，而發(fā)為本病[10]。我們從證候研究發(fā)現(xiàn)，AS患者多表現(xiàn)為腰背部或骶髂部疼痛，夜間明顯，以及晨僵等，逐漸累積至整條脊柱督脈所過(guò)之處，且伴隨怕冷、四肢不溫等腎虛表現(xiàn)，提示本病發(fā)生與先天不足、腎虛督寒有關(guān)。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，患者出現(xiàn)夢(mèng)中流涎、大便不調(diào)等脾虛濕阻表現(xiàn)，推測(cè)后天脾土參與疾病發(fā)生的全過(guò)程，因脾失運(yùn)化，痰濕內(nèi)生，土濕克腎水，阻礙經(jīng)絡(luò)，從而加重腎虛督虧的情況?；诖x組學(xué)，結(jié)合炎癥指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者相比，腎虛督寒型AS患者的代謝網(wǎng)絡(luò)存在異常，以下從不同的代謝途徑展開(kāi)討論。

3.1能量代謝異常與AS的關(guān)系丙氨酸是參與葡萄糖代謝的重要產(chǎn)物，作為非必需氨基酸，在肝臟脫去氨基變成丙酮酸，后者再作為載體，經(jīng)肝的糖異生再次生成葡萄糖，輸送到肌肉進(jìn)行有氧代謝。我們發(fā)現(xiàn)AS患者丙氨酸水平升高，提示外周肌肉組織對(duì)葡萄糖利用障礙。而中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾主四肢，若脾陽(yáng)虛衰，則四肢不溫。因此，本研究中大部分患者具有四肢不溫癥狀，我們推測(cè)這可能與外周肌肉對(duì)葡萄糖的利用減少有關(guān)。

葡萄糖進(jìn)行有氧代謝，生成丙酮酸，隨后進(jìn)入三羧酸循環(huán)。后者經(jīng)異構(gòu)并氧化脫羧生成α-酮戊二酸，再氧化脫氨生產(chǎn)谷氨酸，在此過(guò)程中為機(jī)體提供能量，維持正常生命活動(dòng)活力。我們發(fā)現(xiàn)AS患者α酮戊二酸及谷氨酸水平升高，提示代謝途徑受阻，存在能量代謝異常。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)AS患者多表現(xiàn)為腰痛，夜間尤甚，以及惡寒怕冷、四肢不溫等一派虛寒之象，謝國(guó)倩等[11]認(rèn)為與患者腎-脾軸功能減退相關(guān)。由于有氧代謝均在線粒體發(fā)生，因此我們推測(cè)患者腎-脾軸功能可能與線粒體功能異常相關(guān)。

3.2脂質(zhì)代謝通路與AS的關(guān)系膽堿是組成卵磷脂的主要成分，在肝臟與腎臟中進(jìn)一步生產(chǎn)甜菜堿，后者內(nèi)含三個(gè)活性甲基，具有高度化學(xué)活性，可分解為三甲胺，提供甲基以合成甘氨酸。甜菜堿及甘氨酸均具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)作用，抑制炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，使炎癥因子及氧自由基合成下降，同時(shí)改善脂類代謝，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)[12-13]。N-乙酰天冬酰胺與膽堿結(jié)合，生成磷脂酰膽堿。CUPPEN B V J等[14]研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰膽堿與CRP結(jié)合以啟動(dòng)宿主免疫反應(yīng)，而脂肪酸具有促進(jìn)炎癥效果，能與IL-6、TNF-α等抗炎分子的前體相結(jié)合，釋放炎癥介質(zhì)。He Z X等[15]通過(guò)檢測(cè)AS患者糞便代謝物發(fā)現(xiàn)類固醇化合物存在性別差異，但AS發(fā)病率是否與性別相關(guān)，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)AS患者的膽堿、甜菜堿、三甲胺水平下降，甘氨酸及脂類化合物水平上升，提示患者甜菜堿-甘氨酸代謝通路、膽堿、脂質(zhì)代謝通路異常，而且CRP、ESR、IL-6及TNF-α等炎癥指標(biāo)明顯升高，因此我們推測(cè)上述通路參與炎癥反應(yīng)激活途徑。

3.3氨基酸代謝通路與AS的關(guān)系本研究發(fā)現(xiàn)AS患者的氨基酸水平發(fā)生異常。支鏈氨基酸包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等，經(jīng)脫氨基生成糖類、酮類，后者形成乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)。AS患者的上述3種氨基酸含量上升說(shuō)明氨基酸代謝發(fā)生異常改變，使得氨基酸不能正常地進(jìn)入三羧酸循環(huán)，糖酵解增強(qiáng)，從而增加氧化應(yīng)激及細(xì)胞受損[16]。

人體中有多種神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)活性物質(zhì)如腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺等，酪氨酸是這些物質(zhì)合成的基礎(chǔ)[17]。它是由苯丙氨酸羥基化生成，為神經(jīng)遞質(zhì)合成前體。本研究發(fā)現(xiàn)AS患者的酪氨酸水平上升，提示酪氨酸代謝通路受阻，我們推測(cè)其可能對(duì)神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響，從而造成患者怕冷、夢(mèng)中流涎等腎虛表現(xiàn)，這有助于進(jìn)一步解釋AS患者腎虛督寒的形成機(jī)制。

3.4免疫功能紊亂與AS的關(guān)系蘇氨酸具有促進(jìn)磷脂合成及使脂肪酸進(jìn)一步氧化，作為免疫球蛋白的主要合成原料，參與人體免疫反應(yīng)，其缺乏時(shí)，影響免疫代謝，降低人體抵抗病毒與體內(nèi)細(xì)胞異常增殖的能力下降[18]。本研究發(fā)現(xiàn)患者的蘇氨酸水平下降，提示AS患者存在免疫異常。

脯氨酸、精氨酸均參與人體細(xì)胞凋亡。郭棚[19]研究發(fā)現(xiàn)，在體外培植時(shí)，增加精氨酸可使母豬滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖增加，細(xì)胞凋亡受抑制。而脯氨酸能加速牙釉質(zhì)修復(fù)，在代謝中，生產(chǎn)羥脯氨酸和羥賴氨酸，后者是合成膠原蛋白，促進(jìn)軟骨愈合的原料。AS患者大多表現(xiàn)為骶髂關(guān)節(jié)軟骨破壞，骨質(zhì)增生融合，同時(shí)合并外周關(guān)節(jié)附著點(diǎn)炎癥，這些表現(xiàn)均與軟骨及膠原蛋白異常有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，腎主骨，藏精而生髓。病理情況下，督虛元?dú)馐Р?，不能生髓，“髓”功能異常，臨床表現(xiàn)為腰痛、晨僵、脊柱活動(dòng)指數(shù)下降。本研究發(fā)現(xiàn)，AS患者的脯氨酸、精氨酸代謝下降，引起免疫功能紊亂，細(xì)胞凋亡加快，軟骨修復(fù)減慢，從而導(dǎo)致骶髂關(guān)節(jié)炎癥，是“腎主髓”功能下降的表現(xiàn)形式之一。

3.5腸道功能紊亂與AS的關(guān)系在人體腸道絨毛上部成熟線粒體中，存在谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)，谷氨酸與谷氨酰胺互相轉(zhuǎn)換，生產(chǎn)大量三磷酸腺苷（ATP），為腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)代謝提供能量，能有效改善膿毒癥患者腸黏膜屏障功能[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)AS患者谷氨酰胺水平下降，谷氨酸鹽水平上升，比例失調(diào)，提示谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)障礙，腸道能量利用受阻。中醫(yī)的脾主運(yùn)化，應(yīng)涵蓋了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)胃腸道功能范疇。脾土久虛（腸道能量不足），氣血生化無(wú)源，可進(jìn)一步導(dǎo)致腎虛失養(yǎng)而引發(fā)本病，故我們推測(cè)谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)障礙可能是其發(fā)病機(jī)制之一。

腸道微生物將飲食中的芳香族化合物分解成苯酸鹽，后者在肝腎中與甘氨酸結(jié)合，形成馬尿酸鹽，是腸道菌群代謝產(chǎn)物，參與腸道炎癥反應(yīng)。臨床研究[22-23]發(fā)現(xiàn)，AS患者往往伴發(fā)腹瀉、腹痛等炎癥腸病。我們的證候研究結(jié)果也提示大部分AS患者伴隨大便不調(diào)情況，可能與腸道菌群代謝失調(diào)相關(guān)。脾虛生濕，濕濁內(nèi)陷，濕土克于腎水，影響脾-腎功能軸而發(fā)為本病。因此，我們推測(cè)脾虛生“濕”，可能與胃腸道菌群失調(diào)有關(guān)，需要后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究使用1H-NMR技術(shù)的代謝組學(xué)方法，探討了腎虛督寒型AS患者血中代謝產(chǎn)物的變化趨勢(shì)，初步篩選出亮氨酸、異亮氨酸、脂類化合物、谷氨酸鹽、α-酮戊二酸、甘氨酸、馬尿酸鹽、酪氨酸、苯丙氨酸、甜菜堿、谷氨酰胺、脯氨酸、纈氨酸、膽堿、三甲胺、精氨酸、蘇氨酸等物質(zhì)作為本病的早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，涉及8條代謝通路。提示腎虛督寒型AS的發(fā)病機(jī)制可能與患者的能量代謝、氨基酸代謝、脂類代謝以及胃腸道菌群和免疫紊亂等代謝異常有關(guān)，從而從多方面影響脾-腎功能軸而形成腎虛督寒病機(jī)。但由于我們僅分析血清中的代謝，具有一定局限性，仍需要后期完善免疫復(fù)合物檢測(cè)及病理，來(lái)驗(yàn)證本研究結(jié)論。