人工繁養(yǎng)湘華鯪性腺發(fā)育的組織學(xué)研究

鄒利，李傳武，蔣國(guó)民，楊鑫，王金龍

（1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410153；2.湖南省水產(chǎn)原種場(chǎng)，湖南 長(zhǎng)沙 410153；3.湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000）

湘華鯪Sinilabeo decorus tungting（Nichols）隸屬鲃亞科Barbinae、華鯪屬Sinilabeo，是湖南省特有的一種野生魚(yú)類(lèi)，在湘、資、沅、澧四水的中上游均有分布[1]。據(jù)調(diào)查，1996～2000 年湖南沅水流域湘華鯪年產(chǎn)量為7.60 t，2006～2010 年為0.85 t，2016～2018 年年產(chǎn)量?jī)H剩0.1～0.2 t，湘華鯪種群數(shù)量急劇減少，資源現(xiàn)狀已為瀕危等級(jí)，列為沅水特有魚(yú)類(lèi)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)重點(diǎn)保護(hù)魚(yú)類(lèi)[2]。為保護(hù)開(kāi)發(fā)利用野生湘華鯪資源，本課題組在湖南懷化和邵陽(yáng)等地共收集野生湘華鯪400 余尾，進(jìn)行人工馴養(yǎng)和繁殖。2011 年在國(guó)內(nèi)首次成功繁育湘華鯪子一代20 余萬(wàn)尾，分別飼養(yǎng)于湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所（池塘）和洪江區(qū)橫巖庫(kù)區(qū)湘華鯪保育點(diǎn)（江河網(wǎng)箱）。目前，我國(guó)湘華鯪主要進(jìn)行了人工繁殖、營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)及消化系統(tǒng)組織觀察等研究[3-6]，而有關(guān)養(yǎng)殖湘華鯪的性腺發(fā)育及繁殖生物學(xué)的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察池塘養(yǎng)殖的1～7 齡湘華鯪子一代性腺的組織切片，探究湘華鯪子一代性腺發(fā)育特征與規(guī)律，以豐富湘華鯪人工繁殖理論，為規(guī)模化養(yǎng)殖及資源增殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2011—2017 年，本課題組經(jīng)人工催產(chǎn)獲得了湘華鯪苗種。1～7 齡湘華鯪子一代分批養(yǎng)殖于湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所池塘。于2018 年3 月7 日、4 月8日、4 月23 日和5 月3 日，分四次采集湘華鯪子一代，每次每年齡組采魚(yú)4～6 尾，共計(jì)154 尾。

1.2 方法

測(cè)定實(shí)驗(yàn)魚(yú)的全長(zhǎng)、體質(zhì)量，快速解剖，觀察記錄性腺的外形特征，稱量性腺重，計(jì)算性腺指數(shù)（GSI）＝（性腺質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。取性成熟的雌性親本測(cè)定絕對(duì)懷卵量。絕對(duì)懷卵量=（卵巢樣品卵粒數(shù)/卵巢樣品重）×卵巢重[7-9]。將性腺切割成小于1 m3的組織塊（幼魚(yú)性腺不用切割），組織塊于波恩氏液中固定24 h。固定好的性腺組織塊，經(jīng)梯度酒精脫水，石蠟包埋切片（厚6～8 μm），HE 染色，最后樹(shù)膠封片。Nikon 顯微鏡觀察并攝影，采用Caseviewer 軟件進(jìn)行測(cè)微尺計(jì)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示[10]，采用Excel 2007 和SPSS 17.0 等軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘華鯪的生長(zhǎng)與性腺發(fā)育

3—5 月，池塘養(yǎng)殖的不同年齡的湘華鯪性腺發(fā)育情況如下：1 齡湘華鯪性腺發(fā)育處于Ⅰ期末期；2齡湘華鯪性腺處在Ⅱ期；3 齡、4 齡湘華鯪的卵巢和精巢發(fā)育基本處于Ⅱ期～Ⅲ期，5 月上旬發(fā)現(xiàn)1 尾4 齡雄性的精巢發(fā)育至Ⅳ期；5 齡湘華鯪的卵巢處于Ⅲ期～Ⅳ期，5 齡雄性個(gè)體的性腺為Ⅳ期；6 齡、7齡個(gè)體均性成熟，在3 月卵巢處于Ⅲ期晚期～Ⅳ期早期，在4—5 月性腺為Ⅳ期卵巢或處于向Ⅴ期卵巢過(guò)渡的階段（表1）。

在繁殖季節(jié)，性成熟的雌性湘華鯪性體指數(shù)可達(dá)10.97%，卵巢膨大，卵粒清晰可見(jiàn)，脈絡(luò)清晰的血管覆在結(jié)締組織被膜上（圖版Ⅰ-1），發(fā)育到Ⅳ期晚期。成熟卵排出后，卵巢松弛、萎縮、大量充血，呈紅色透明狀，基本無(wú)卵粒殘留（圖版Ⅰ-3）。共采集到7尾性成熟雌湘華鯪，絕對(duì)懷卵量最少16 046 粒，最多29 127 粒，平均懷卵量為23 509 粒。性成熟雄魚(yú)的性腺指數(shù)可達(dá)5.54%，精巢發(fā)育至Ⅳ期晚期，有精液排出，呈乳白色（圖版Ⅰ-2）。精液排出后，精巢呈淡紅色（圖版Ⅰ-4）。

2.2 性腺的形態(tài)特征及分期

表1 1～7 齡湘華鯪在池塘養(yǎng)殖條件下的生長(zhǎng)和性腺發(fā)育情況Tab.1 Growth and gonadal development of 1～7－year－old Sinilabeo decorus tungting cultured in a pond

湘華鯪的精巢成對(duì)分布在腹腔上方，大部分呈軸對(duì)稱的細(xì)線狀或棒狀結(jié)構(gòu)，偶見(jiàn)兩邊精巢大小存在明顯差異。湘華鯪的卵巢同樣成對(duì)分布在腹腔上方，大部分成對(duì)同形，早期呈細(xì)線狀或扁平條狀，成熟時(shí)膨大為棒狀或長(zhǎng)囊狀。根據(jù)湘華鯪的性腺外形和組織切片觀察結(jié)果，參考劉筠的分期標(biāo)準(zhǔn)[7]，湘華鯪的精巢和卵巢發(fā)育可分為6 個(gè)時(shí)期。

2.2.1 精巢發(fā)育的分期

Ⅰ期精巢呈透明的細(xì)線狀，性腺被黑色的腹膜包裹，Ⅰ期的精巢和卵巢不能通過(guò)肉眼分辨。切片觀察，精巢橫切面為橢圓或扁圓形。精原細(xì)胞（Spermatogonium）零散分布于精巢基質(zhì)中，細(xì)胞直徑為8～15 μm，其細(xì)胞核中位，嗜堿性強(qiáng)，呈深紫色，細(xì)胞核直徑為5～7 μm（圖版Ⅱ-1）。

Ⅱ期精巢呈白色的細(xì)棒狀，質(zhì)地緊密，Ⅱ期精巢與卵巢可通過(guò)肉眼分辨。Ⅱ期精巢相比Ⅰ期精巢，精原細(xì)胞數(shù)量顯著增加且排列成束，由支持細(xì)胞、血細(xì)胞等結(jié)締組織細(xì)胞包裹，形成精小葉雛形。在3—5 月,魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)較快，處在Ⅱ期的精巢也快速發(fā)育，精小葉快速增加，此時(shí)期支持細(xì)胞、紅細(xì)胞也大量增加（圖版Ⅱ-2、3）。

Ⅲ期精巢呈細(xì)棒狀，白色，橫切面呈扁圓形或三角形。Ⅲ期精巢開(kāi)始出現(xiàn)多種類(lèi)型的生殖細(xì)胞，生殖細(xì)胞以小葉腔為單位同步發(fā)育。初級(jí)精母細(xì)胞（Primary spermatocyte）由精原細(xì)胞分裂形成，圓形，細(xì)胞質(zhì)為嗜堿性，細(xì)胞核染色深，細(xì)胞直徑為3.4～4.6 μm，比精原細(xì)胞小。由初級(jí)精母細(xì)胞分裂形成的次級(jí)精母細(xì)胞（Secondary spermatocyte），平均細(xì)胞直徑為2.29 μm，其細(xì)胞核的嗜堿性進(jìn)一步增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)已經(jīng)很少。此時(shí)期的精巢還有少量精原細(xì)胞和精子細(xì)胞（圖版Ⅱ-4、5）。

Ⅳ期精巢呈中間渾圓，兩端尖窄的棒狀，乳白色，橫切面為橢圓形或半圓形。到Ⅳ期末，用手?jǐn)D壓湘華鯪腹部，能從泄殖孔擠出少量白色的精液。此時(shí)期的生殖細(xì)胞主要由精子細(xì)胞（Spermatid）和精子（Spermatozoon）組成，同時(shí)也存在少量精原細(xì)胞及其他生精細(xì)胞。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，小葉腔內(nèi)的精子細(xì)胞和精子均呈一個(gè)染色很深的圓形；精子細(xì)胞平均直徑為1.6 μm，精子頭部平均直徑為

0.9 μm（圖版Ⅱ-6、7、8）。

Ⅴ期精巢柔軟而膨脹，輕壓腹部，大量乳白色的精子會(huì)流出泄殖孔。4 月下旬—5 月初，養(yǎng)殖湘華鯪的Ⅳ期精巢經(jīng)人工催產(chǎn)能順利過(guò)渡到Ⅴ期。此期大量精子呈游離狀態(tài)分布于小葉腔，而小葉腔中間形成一個(gè)空腔并逐漸增大，同時(shí)也存在少量精原細(xì)胞及其他生精細(xì)胞（圖版Ⅱ-9、10）。

Ⅵ期精巢為排精后的精巢，其血管更加明顯而呈淡紅色，其體積也因精子的排出而縮小，但本實(shí)驗(yàn)中雄魚(yú)排出的精液量少，與Ⅴ期精巢的組織切片結(jié)果差異不明顯。

2.2.2 卵巢發(fā)育的分期

Ⅰ期卵巢為白色透明的細(xì)線狀，外形與Ⅰ期精巢相似。Ⅰ期卵巢晚期的生殖細(xì)胞為卵原細(xì)胞和第1 時(shí)相的卵母細(xì)胞。第1 時(shí)相卵母細(xì)胞的細(xì)胞核大，約占細(xì)胞的一半，核中部有1～3 個(gè)核仁，細(xì)胞直徑13～42 μm，核徑6～25 μm（圖版Ⅲ-1），排列緊密，靠近卵巢壁的卵母細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快。

Ⅱ期卵巢為淡黃色透明的扁帶狀，卵巢開(kāi)始出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的板層狀結(jié)構(gòu)，即產(chǎn)卵板，明顯區(qū)別于Ⅱ期精巢。切片觀察，Ⅱ期卵巢以第2 時(shí)相的卵母細(xì)胞為主，早期有少量第1 時(shí)相的卵母細(xì)胞，晚期開(kāi)始有少量第2 時(shí)相的卵母細(xì)胞向第3 時(shí)相過(guò)渡。第2 時(shí)相卵母細(xì)胞由于胞質(zhì)的增加，細(xì)胞體積快速增大，因此細(xì)胞相互擠壓而呈不規(guī)則的多邊形；細(xì)胞質(zhì)嗜堿性，HE 染色呈深藍(lán)色；細(xì)胞核也相應(yīng)增大，核淺紫色，位于細(xì)胞中央；靠近核膜內(nèi)側(cè)分布著核仁，在同一切面核膜內(nèi)側(cè)有4～15 個(gè)核仁。第2時(shí)相卵母細(xì)胞處于初級(jí)卵母細(xì)胞的小生長(zhǎng)期，細(xì)胞體積可增加60 倍以上，直徑47～231 μm，核徑25～94 μm（圖版Ⅲ-2、3、4）。

Ⅲ期卵巢為淺黃色的帶狀，肉眼能見(jiàn)少量卵粒。卵巢擴(kuò)大，分布于卵膜上方的血管較粗大。卵巢中以第3 時(shí)相的卵母細(xì)胞為主。與第2 時(shí)相卵母細(xì)胞相比，第3 時(shí)相的卵母細(xì)胞體積更大，染色較淺。第3 時(shí)相卵母細(xì)胞處于初級(jí)卵母細(xì)胞的大生長(zhǎng)期早期階段，細(xì)胞質(zhì)中開(kāi)始出現(xiàn)染成淡紅色的小顆粒，即卵黃顆粒；細(xì)胞質(zhì)的外緣先出現(xiàn)幾層透明的小液泡；卵母細(xì)胞卵膜加厚，開(kāi)始出現(xiàn)較薄的輻射帶，平均厚度為1.4 μm。在質(zhì)膜的外側(cè)有一層扁平的濾泡細(xì)胞，其細(xì)胞核染色深，且呈扁平狀。第3 時(shí)相卵母細(xì)胞體積顯著增大，核仁數(shù)目增多，細(xì)胞直徑165～489 μm，核徑43～186 μm（圖版Ⅲ-5、6）。

Ⅳ期卵巢呈黃色，體積繼續(xù)膨大，卵巢膜內(nèi)包裹著大量淡黃色卵粒。Ⅳ期卵巢以第4 時(shí)相卵母細(xì)胞為主，早期有少量第2、3 時(shí)相卵母細(xì)胞，而Ⅳ期末時(shí)第4 時(shí)相卵母細(xì)胞占切片上卵數(shù)的85%以上，占切片面積的96%以上，且卵徑大小比較整齊、發(fā)育趨于同步。第4 時(shí)相卵母細(xì)胞處于初級(jí)卵母細(xì)胞大生長(zhǎng)期的晚期，3—5 月，卵黃顆粒迅速積累，充滿了除液泡層外的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核也發(fā)生偏位，輻射帶增厚，平均厚度為3.6 μm。濾泡膜由兩層濾泡細(xì)胞構(gòu)成。第4 時(shí)相卵母細(xì)胞早期直徑471～1093 μm；而晚期直徑為1374～1764 μm（圖版Ⅲ-7、8）。

Ⅴ期卵巢呈黃色，卵粒游離在卵腔中，輕壓腹部就會(huì)流出體外。此期卵粒飽滿，略帶光澤。Ⅴ期卵巢以第5 時(shí)相卵母細(xì)胞為主，其卵黃顆粒融合成板塊狀，且卵母細(xì)胞與濾泡膜處于分離狀態(tài)。第5 時(shí)相卵母細(xì)胞的直徑為（1730.52±89.68）μm（圖版Ⅲ-9）。

Ⅵ期卵巢呈半透明的深紅色，由于成熟卵的排出，卵巢顯著萎縮、大量充血。卵巢中有少量第2、第3 時(shí)相的卵母細(xì)胞和大量空濾泡，還有極少量正處于退化階段的未產(chǎn)出的卵粒，性成熟個(gè)體產(chǎn)卵后的卵巢屬于Ⅵ期卵巢（圖版Ⅲ-10）。

3 討論

3.1 池塘養(yǎng)殖下湘華鯪的性腺特征

據(jù)文獻(xiàn)記載，野生湘華鯪群體中雌、雄個(gè)體最小性成熟年齡為2 齡，群體完全性成熟需要到3 齡[1,2]。繁殖季節(jié)，性成熟的雌性個(gè)體性腺指數(shù)為（15.72±2.26）%，懷卵量8～10 萬(wàn)，卵徑（2.11±0.13）mm[1,2]。本研究中，池塘養(yǎng)殖人工繁育的湘華鯪子一代性腺發(fā)育良好，能進(jìn)行催產(chǎn)繁殖。但與野生群體相比，池塘養(yǎng)殖湘華鯪的性腺發(fā)育狀況存在以下不同：（1）性腺發(fā)育較野生群體遲緩，群體完全性成熟年齡推遲了2 年；（2）養(yǎng)殖群體中性成熟雌魚(yú)的性腺指數(shù)最高為10.97%，懷卵量2～3 萬(wàn)，卵徑（1.73±0.89）mm，表明湘華鯪子一代培育的性腺發(fā)育還需要進(jìn)一步研究與探索。性體指數(shù)、懷卵量及卵徑是衡量魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育和性腺質(zhì)量的重要數(shù)量指標(biāo)[11]。親魚(yú)的性腺發(fā)育和卵黃形成是親魚(yú)培育的關(guān)鍵，此過(guò)程受水環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)飼料及日常管理等多重因素的影響[12-15]。野生湘華鯪在河灘覓食，分批洄游至有急流的場(chǎng)地產(chǎn)卵，運(yùn)用池塘循環(huán)水槽養(yǎng)殖模式開(kāi)展仿生態(tài)的流水養(yǎng)殖，能否促進(jìn)養(yǎng)殖湘華鯪的性腺發(fā)育，還需要進(jìn)一步的研究。

3.2 養(yǎng)殖湘華鯪精巢結(jié)構(gòu)及發(fā)育特點(diǎn)

魚(yú)類(lèi)精巢從分化到成熟，主要經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生等變化，一般分為六個(gè)時(shí)期[16]。魚(yú)類(lèi)的精巢按照生殖細(xì)胞的排列方式及分布特點(diǎn)，一般為小葉型精巢和管型精巢兩種類(lèi)型[7,17-19]。大部分鯉科魚(yú)類(lèi)精巢為小葉型[10,12,20]，本研究組織觀察發(fā)現(xiàn)，湘華鯪精巢屬于小葉型精巢。4 齡及以上的性成熟雄湘華鯪，3 月時(shí)精巢處Ⅲ～Ⅳ期，在4 月下旬—5 月初精巢可自然發(fā)育至第Ⅳ～Ⅴ期，這說(shuō)明養(yǎng)殖湘華鯪的精巢發(fā)育良好，已經(jīng)具備催產(chǎn)條件。

3.3 養(yǎng)殖湘華鯪卵巢發(fā)育及產(chǎn)卵類(lèi)型

卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩個(gè)生長(zhǎng)期發(fā)育成熟，第2 時(shí)相的卵母細(xì)胞的胞質(zhì)增多為第一個(gè)小生長(zhǎng)期，第3、4時(shí)相卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)為第二個(gè)大生長(zhǎng)期，此期卵黃顆粒大量積累、輻射膜增厚、細(xì)胞核移位[7]。大部分5 齡左右的養(yǎng)殖湘華鯪卵巢才發(fā)育至Ⅳ期。養(yǎng)殖湘華鯪雌魚(yú)性成熟年齡為5+，大于雄魚(yú)的性成熟年齡4+。這可能與雌湘華鯪在性成熟過(guò)程中需要更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累有關(guān)，尤其是卵黃形成期，除了積累卵黃，還需要合成和積累各類(lèi)RNA、糖原顆粒、核糖體、脂質(zhì)及線粒體等物質(zhì)[21,22]。

根據(jù)硬骨魚(yú)類(lèi)卵巢的組織學(xué)特征和產(chǎn)卵習(xí)性，產(chǎn)卵類(lèi)型可劃分為一次性產(chǎn)卵和多次性產(chǎn)卵[8,17,23,24]。隨著湘華鯪卵巢發(fā)育進(jìn)入Ⅳ期末，第4 時(shí)相卵母細(xì)胞占切片面積的96%以上，卵徑大小比較整齊，第3時(shí)相卵母細(xì)胞已很少，說(shuō)明湘華鯪卵巢內(nèi)的卵母細(xì)胞是同步成熟。產(chǎn)后的卵巢中基本無(wú)第4 時(shí)相卵母細(xì)胞，第3 時(shí)相的卵母細(xì)胞處于退化階段，只剩下第2 時(shí)相的卵母細(xì)胞和大量空濾泡（圖版Ⅲ-10），說(shuō)明養(yǎng)殖湘華鯪和野生湘華鯪都是一年產(chǎn)卵一次。養(yǎng)殖湘華鯪卵巢發(fā)育放緩且一年產(chǎn)卵一次，建議在五月初選擇6 齡以上雌性、5 齡以上雄性的親本進(jìn)行催產(chǎn)，提高繁殖效率，也有利于親魚(yú)保護(hù)。

圖版Ⅰ 湘華鯪性腺解剖圖Plate Ⅰ Gonads in Sinilabeo decorus tungting

圖版Ⅱ 湘華鯪的精巢發(fā)育Plate Ⅱ Characteristics of testis development at different stages in Sinilabeo decorus tungting