黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的累加細(xì)胞毒性研究

王曉敏， 常 娟， 王 平， 尹清強(qiáng)*， 劉超齊， 朱 群， 彭 峰， 楊小進(jìn)

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州450046；2.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng)453000；3.河南省正陽(yáng)種豬場(chǎng)，河南正陽(yáng)463612；4.洛陽(yáng)歐科拜克生物技術(shù)股份有限公司，河南宜陽(yáng)471611）

霉菌毒素廣泛存在于糧食和動(dòng)物飼料中，其是由真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物（Cimbalo 等，2020），目前大約有100 多種真菌產(chǎn)生300 多種霉菌毒素（Wei 等，2019）。 我國(guó)2018 年飼料和原料中霉菌毒素污染情況調(diào)查報(bào)告顯示，全國(guó)約99%的飼料和原料不同程度受到霉菌毒素污染， 其中85%以上的飼料和原料被2 種或2 種以上的霉菌毒素污染（雷元培等，2020）。 分析其原因主要如下：（1）一種霉菌可能會(huì)產(chǎn)生多種毒素，例如黃曲霉菌會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素和桔霉素，禾谷鐮孢菌會(huì)產(chǎn)生玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素等；（2）不同地區(qū)、不同環(huán)境、不同飼料受霉菌毒素污染的種類和嚴(yán)重程度不同， 當(dāng)用來(lái)自不同地區(qū)和不同飼料原料來(lái)配制畜禽飼糧時(shí)， 導(dǎo)致多種霉菌毒素的污染不可避免。 在動(dòng)物飼料中常見且危害較大的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、嘔吐毒素（DON）。這三種霉菌毒素能夠降低畜禽生產(chǎn)性能和機(jī)體免疫力， 對(duì)機(jī)體具有致癌性、基因毒性和生殖毒性，可嚴(yán)重危害機(jī)體健康 （黃珂等，2019；Meissommier 等，2006；Wang和Groopman，1999）。 據(jù)報(bào)道，多種霉菌毒素協(xié)同或累加作用對(duì)動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能的危害要比單一霉菌毒素作用的危害更大（Chang 等2020；李彥伸等，2020；Huang 等，2019）。 為了探索多種霉菌毒素的互作及累加細(xì)胞毒性， 本研究通過(guò)體外培養(yǎng)仔豬腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）試驗(yàn)，探究AFB1、ZEA 和DON 不同配比對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞活力的聯(lián)合損傷作用， 為后續(xù)研究多種霉菌毒素的同步降解奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 DON 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，ZEA 和AFB1購(gòu)自Sigma 公司；DON 定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇省蘇微微生物研究有限公司，AFB1和ZEA 定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)RBiopHarm 公司；仔豬腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基的配制及細(xì)胞活力的測(cè)定（MTT 法）細(xì)胞培養(yǎng)基：10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液和89%高糖培養(yǎng)液充分混合均勻，4 ℃保存?zhèn)溆?。取?duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化計(jì)數(shù)后接種至96 孔板，100 μL/孔，每孔細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸棄掉原培養(yǎng)液，加入PBS 緩沖液清洗一遍，分別加入不同濃度的用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的霉菌毒素， 對(duì)照組加入與試驗(yàn)組相同體積的培養(yǎng)基， 每個(gè)處理組6 個(gè)重復(fù)。 24 h 后每孔加入10 μL 的MTT （終濃度為0.5 mg/mL），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共同孵化4 h后，小心吸走培養(yǎng)液，加入150 μL 的DMSO，在低速振蕩器上振蕩10 min 使得甲瓚充分溶解，在酶標(biāo)儀下測(cè)其490 nm 和630 nm 處的吸光度值（OD值），根據(jù)OD 值計(jì)算細(xì)胞活率公式為：細(xì)胞活力/%=（試驗(yàn)組OD490nm值-試驗(yàn)組OD630nm值）/（對(duì)照組OD490nm值-對(duì)照組OD630nm值）×100。

1.3 AFB1、ZEA、DON 對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)的響應(yīng)面設(shè)計(jì) 利用Design-Expert 8.0.6 軟件，將AFB1、ZEA 和DON 作為響應(yīng)面Box-Behnke 設(shè)計(jì)的三個(gè)因素， 以AFB1：10、20、30 μg/L，ZEA：150、300、450 μg/L，DON：500、1000、1500 μg/L 分別作為Box-Behnke 設(shè)計(jì)三因素的三個(gè)編碼水平。 設(shè)計(jì)因素與編碼水平見表1。 將試驗(yàn)結(jié)果輸入Design-Expert 軟件進(jìn)行分析，得出回歸方程。根據(jù)線性回歸方程， 得出霉菌毒素導(dǎo)致細(xì)胞高損傷和低損傷的組合比例。 為了體現(xiàn)自變量和因變量的關(guān)系，采用二次多項(xiàng)方程進(jìn)行擬合，預(yù)測(cè)二次多項(xiàng)方程式如下：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X12+β22X22+β33X32+β12X1X2+β13X1X3+β23X2X3+β112X12X2+β113X12X3+β122X1X22；式中：Y 為細(xì)胞活力，%；X1、X2、X3為自變量， 分別對(duì)應(yīng)AFB1、ZEA 和DON；β0為截距；β1、β2、β3為線性系數(shù)；β11、β22、β33為平方系數(shù)；β12、β13、β23、β112、β113、β122為交叉系數(shù)。

表1 Box-Behnke 設(shè)計(jì)因素及編碼水平 μg/L

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步整理后，采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行One way ANOVA 方差統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較。 所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P < 0.05 表示差異顯著，P > 0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不 同AFB1、ZEA 和DON 配 比 對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活力的影響 由表2 可知， 試驗(yàn)1 組細(xì)胞活力最高，為50.05%，與試驗(yàn)6 組差異不顯著（P ＞0.05），顯著高于其余各組（P ＜0.05）；試驗(yàn)17 組細(xì)胞活力最低，為39.02%，與試驗(yàn)1、6 組差異顯著（P ＜0.05），與其余各組差異不顯著（P ＞0.05）。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)參數(shù)與細(xì)胞活力

2.2 響應(yīng)面模型構(gòu)建及方差分析 把17 組霉菌毒素組合對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞活力作為響應(yīng)值Y，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)模型進(jìn)行二次回歸分析， 可得出回歸方程：Y=39.67+0.83X1-0.11X2-1.31X3+2.28X1X2-0.83X1X3-0.13X2X3+2.72X12+1.78X22-0.85X32-0.50X12X2-0.99X12X3-3.81X1X22。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，該回歸模型P ＜0.05，決定系數(shù)R2=0.97，表明該模型擬合度較好。從方程方差分析表P 值可得出各因素對(duì) 響 應(yīng) 值 的 影 響 程 度，X1、X2、X3、X1X3、X2X3、X32、X12X2和X12X3對(duì)響應(yīng)值的影響均不顯著 （P ＞0.05），X1X2和X22對(duì) 響 應(yīng) 值 的 影 響 顯 著 （P ＜0.05），X12、X1X22的影響極顯著（P ＜0.01），說(shuō)明AFB1和ZEA 及其交互作用對(duì)細(xì)胞活力有顯著影響（P ＜0.05）。經(jīng)方程預(yù)測(cè)后，得到細(xì)胞活力最低（霉菌毒素毒性最高）的AFB1、ZEA 和DON 組合為30、150 μg/L 和1500 μg/L， 經(jīng)測(cè)定細(xì)胞活力為32.32%；得到細(xì)胞活力最高（霉菌毒素毒性最低）的AFB1、ZEA 和DON 組合為10、150 μg/L 和600 μg/L，經(jīng)測(cè)定細(xì)胞活力為53.01%。

表3 細(xì)胞活力作為響應(yīng)值時(shí)回歸方程的方差分析

3 討論

動(dòng)物腸道是抵抗霉菌毒素侵入的第一道防線，動(dòng)物攝入被霉菌毒素污染的飼料后，會(huì)引起腸道上皮細(xì)胞受損，以及嚴(yán)重腸道炎性反應(yīng)，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和消化功能以及腸道免疫力， 增加傳染病的感染系數(shù)（潘佳雯等，2018）。在嚴(yán)重情況下，還可導(dǎo)致動(dòng)物死亡，并通過(guò)食物鏈在人和動(dòng)物體內(nèi)積聚，從而危及人類和動(dòng)物的健康。有研究表明，AFB1會(huì)損傷動(dòng)物腸道正常的組織形態(tài)， 破壞腸道黏膜的物理屏障功能， 同時(shí)對(duì)腸道化學(xué)屏障和免疫屏障產(chǎn)生影響（齊燦燦等，2017）。 ZEA 是一種雌激素類似物， 其與雌激素受體結(jié)合會(huì)造成動(dòng)物體內(nèi)生殖激素紊亂， 破壞生殖系統(tǒng)、 免疫系統(tǒng)，還具有遺傳毒性和細(xì)胞毒性（Gao 等，2018）。DON 對(duì)細(xì)胞的毒性主要是改變細(xì)胞形態(tài)和分化。促進(jìn)炎性因子的升高和細(xì)胞凋亡， 抑制蛋白合成來(lái)影響腸上皮細(xì)胞完整性 （Pinton 和Oswald，2014）。 多種霉菌毒素累加危害的研究表明，AFB1分別與ZEA 或赭曲霉毒素A（OTA）兩兩聯(lián)合或3種毒素的聯(lián)合均能影響奶山羊腸道微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)，其中3 種毒素聯(lián)合毒性更強(qiáng)，對(duì)腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)影響也越大 （范彩云等，2017）。 武晨清（2020） 用AFM1、OTA 和ZEA 處理Caco-2/HT29-MTX 細(xì)胞后，腸上皮細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，緊密連接蛋白（TJ 蛋白）的形態(tài)改變，TJ 蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞；并證明AFM1與OTA、ZEA 共存時(shí)， 對(duì)腸道屏障功能的影響更為嚴(yán)重， 這與TJ 蛋白定位的改變和黏蛋白分泌的減少有關(guān)。 本研究結(jié)果表明，不同種類和不同劑量的霉菌毒素配伍，對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞的損傷程度不同，得到了多種霉菌毒素導(dǎo)致豬腸道細(xì)胞高損傷和低損傷的組合模型，為研究多種霉菌毒素的累加細(xì)胞毒性及同步降解提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)， 得到了導(dǎo)致IPEC-J2 細(xì) 胞 高 損 傷 和 低 損 傷 的AFB1、ZEA 和ZON 配伍比例，為研究多種霉菌毒素的累加細(xì)胞毒性奠定了基礎(chǔ)。