孔雀石綠膠體金檢測樣品前處理工藝的優(yōu)化

高海崗， 劉秀梵*， 王曉泉， 蔣春茂， 鄭硯超

（1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225009；2.江蘇農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州225300；3.無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司，江蘇無錫214174）

孔雀石綠又叫孔雀綠、堿性綠，是一種人工合成的三苯甲烷類燃料（陳義元，2018），因其在細(xì)菌合成過程中能阻止蛋白肽的形成而具有殺菌效果，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和運(yùn)輸領(lǐng)域。但孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石綠（LMG）具有致癌、致畸和致突變毒性， 已被多國禁用，2002 年農(nóng)業(yè)部頒布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中明確禁止使用孔雀石綠等多種違禁藥物。 但多年來的檢測結(jié)果顯示， 我國部分省市在養(yǎng)殖領(lǐng)域和流通領(lǐng)域還在長期使用（師真等，2020；林锏銳等，2019；范芳芳等，2019），嚴(yán)重危害農(nóng)產(chǎn)品食用安全。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和相關(guān)檢測數(shù)據(jù)顯示，國內(nèi)市面上出售的水產(chǎn)品中孔雀石綠、 硝基呋喃類藥物、 氯霉素的檢出率為6.5% ～ 23.2%（李菊等，2020）。 為快速監(jiān)測養(yǎng)殖領(lǐng)域和流通領(lǐng)域違法使用獸藥，我國出現(xiàn)了大量的快速檢測試劑盒和檢測試紙條。 目前前處理方法一般為使用乙腈、二氯甲烷提取，硼氫化鉀等進(jìn)行還原，使孔雀石綠還原成隱性孔雀石綠檢測（劉柳等，2020；王雪峰等，2018）；或者直接用乙腈提取，中性氧化鋁凈化，直接上機(jī)檢測（朱飛如和馮俊富，2018）。但由于前處理方法過于復(fù)雜，仍然不能保證在有限的時(shí)間內(nèi)，快速、準(zhǔn)確的檢測違禁藥物。本實(shí)驗(yàn)采用提取、氧化、濃縮和復(fù)溶四個(gè)步驟，對氮吹、SPE柱、 反萃取三種不同提取方式進(jìn)行前處理比較，通過膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行檢測，旨在對建立基層快速檢測方法提供指導(dǎo)性建議。

1 材料與方法

1.1 試劑 孔雀石綠快速檢測試紙條、SPE-HLB柱，由無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司提供；氯化鈉、鹽酸羥胺、乙酸鈉、甲醇、無水硫酸鈉、中性氧化鋁、乙酸乙酯、四氯苯醌、乙腈、吐溫-20 均為分析純，購自國藥集團(tuán)；隱性孔雀石綠、孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，購自德國DR.E。

1.2 儀器 振蕩器，購自其林貝爾儀器制造有限公司；離心機(jī)，購自萬合儀器制造有限公司；氮吹儀，購自無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司；固相萃取裝置，購自冠森生物科技（上海）有限公司。

1.3 前處理實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) （kj201701） 樣本的提?。簻?zhǔn)確稱取試樣2 g（精確至0.01 g）置于15 mL 具塞離心管中，用紅色油性筆標(biāo)記，依次加入1 mL飽和氯化鈉溶液，0.2 mL 鹽酸羥胺溶液，2 mL 乙酸鹽緩沖液及6 mL 乙腈，渦旋提取2 min（食品快速檢測方法數(shù)據(jù)庫，2021）。 氧化和濃縮： 加入1 g 無水硫酸鈉，1 g 中性氧化鋁， 渦旋混合1 min，以4600 r/min 離心5 min。 準(zhǔn)確移取5 mL 上清液于15 mL 離心管中， 加入1 mL 正已烷， 充分混勻，以4600 r/min 離心1 min。 準(zhǔn)確移取4 mL 下層液于15 mL 離心管中， 加入100 μL 二氯二氰基苯醌溶液，渦旋混勻，反應(yīng)1 min，于55 ℃水浴中氮?dú)獯蹈伞?復(fù)溶：精密加入200 μL 復(fù)溶液，渦旋混合1 min，作為待測液，立即測定。

1.3.2 氮吹改良方法 樣本的提?。悍Q取去皮、去脂肪并均質(zhì)的樣本5 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品，依次加入3 mL 飽和氯化鈉溶液， 7 mL 乙酸乙酯，于振蕩器上劇烈振蕩3 min，4000 r/min 離心5 min； 氧化和濃縮：取上清4 mL 于7 mL 離心管中， 加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液， 振蕩混勻后， 置于氮吹儀中，65 ℃加熱吹干；復(fù)溶和凈化：取出上述7 mL離心管， 加入2 mL 正己烷， 輕輕振蕩至溶解殘?jiān)?，再加?.8 mL 0.5%吐溫-20 水溶液，于振蕩器上劇烈振蕩1 min，4000 r/min 離心1 min。取出離心管后，去除上層正己烷，下層溶液即為待測液。

1.3.3 反萃取方法 樣本的提取方法同1.3.2；氧化和調(diào)整極性：取上清4 mL 于15 mL 離心管中，加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液，振蕩混勻后，加入10 mL 正己烷，于振蕩器上劇烈振蕩3 min；反萃取：取出上述15 mL 離心管，加入500 μL 0.2 mol/L 硼酸溶液， 于振蕩器上劇烈振蕩1 min，4000 r/min 離心1 min， 去除上層有機(jī)相，取下層溶液400 μL 于2 mL 離心管中，再加入400 μL 0.05 mol/L 四硼酸鈉溶液， 混勻后即為待測液。

1.3.4 SPE 柱法 樣本的提取方法同1.3.2；氧化和調(diào)整極性：取上清4 mL 于15 mL 離心管中，加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液， 振蕩混勻后， 加入10 mL 正己烷， 于振蕩器上劇烈振蕩3 min；SPE 吸附：將上述液體按0.6 mL/min 的速度，勻速過HLB 小柱；SPE 洗脫： 加入1 mL 10%甲醇-水溶液于上述SPE 柱中， 按每秒一滴的速度勻速洗脫，洗脫液即為待測液。

1.4 質(zhì)控實(shí)驗(yàn) 每種樣品同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控實(shí)驗(yàn)。

1.4.1 空白實(shí)驗(yàn) 稱取魚肉樣本， 按照1.3 中不同方法進(jìn)行樣本制備。

1.4.2 加標(biāo)質(zhì)控實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取空白樣本適量，按照梯度加入一定量的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液， 使孔雀石綠濃度為0.25、0.5、1、2、4 ng/mL；準(zhǔn)確稱取空白樣本適量， 按照梯度加入一定量的隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液，使孔雀石綠濃度為0.25、0.5、1、2、4 ng/mL。

1.5 膠體金免疫層析試紙條使用方法及判讀示意圖

1.5.1 使用方法 （1）從原包裝鋁箔袋中取出檢測卡和酶標(biāo)孔，恢復(fù)至室溫；（2）用移液器吸取待檢樣品溶液100 μL 于酶標(biāo)孔中， 反復(fù)吹打至孔內(nèi)紅色物質(zhì)完全溶解，等待反應(yīng)2 min；（3）將檢測卡平放，吸取孔內(nèi)所有溶液滴加到加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)；（4）反應(yīng)5 min 根據(jù)示意圖判斷結(jié)果，其他時(shí)間判讀無效。

1.5.2 結(jié)果判讀 膠體金免疫層析試紙條判讀示意圖如圖1 所示。 陰性結(jié)果：T 線比C 線深，或一樣深，表示樣本中孔雀石綠濃度低于其檢測限；陽性結(jié)果：T 線比C 線淺，或T 線顯綠色，表示樣本中孔雀石綠濃度高于其檢測限；無效反應(yīng)：如果測試結(jié)果C 線未出現(xiàn)，表示此試劑已失效。

圖1 膠體金免疫層析試紙條判讀示意圖

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度比對 分別用行標(biāo)法以及本實(shí)驗(yàn)中的三種前處理方法進(jìn)行最低檢測限，其中氮吹的最低檢測限最低，為隱性孔雀石綠0.5 ng/mL。 SPE 方法的最低檢測限為隱性孔雀石綠1 ng/mL。 反萃取方法和行標(biāo)法的最低檢測限最高，為隱性孔雀石綠2 ng/mL（圖2）。

圖2 不同濃度的LMG 檢測結(jié)果

2.2 四種方法準(zhǔn)確性比對 分別測試了行標(biāo)法以及本實(shí)驗(yàn)中三種前處理方法的準(zhǔn)確性， 在0、0.25、0.5、1、2、4 ng/mL 六種加標(biāo)濃度下， 每種方法每個(gè)濃度分別測試20 份樣本，每種濃度下顯示的陰陽性數(shù)量如表1。 在陰性、檢出限及2 倍檢出限這三個(gè)濃度點(diǎn)上， 四種方法的準(zhǔn)確性均為100%；特別考察了半數(shù)檢出限的準(zhǔn)確性，其中改良氮吹法準(zhǔn)確性最高，假陽性率為10%，行標(biāo)法假陽性率為15%，反萃取法假陽性率為25%，SPE方法假陽性率最高，為40%。

表1 四種方法不同濃度下的陰陽性數(shù)量

2.3 行標(biāo)法及改良的三種方法前處理用時(shí)比對分別對比了行標(biāo)法以及本實(shí)驗(yàn)中三種前處理方法的用時(shí)，結(jié)果見表2。 其中，反萃取法由于省略了氮吹、過柱等步驟，用時(shí)最短，只需要23 min；SPE 法過柱洗脫時(shí)間明顯短于氮吹濃縮的時(shí)間， 用時(shí)32 min； 改良氮吹法相對于行標(biāo)法減少了試劑加入量，且乙酸乙酯揮發(fā)更快，用時(shí)41 min；行標(biāo)法用時(shí)最長，需要48 min。

表2 四種方法前處理用時(shí) min

3 討論

試劑盒是否能用于臨床檢驗(yàn)， 一般通過準(zhǔn)確率、假陽性率、假陰性率、變異系數(shù)、提取率、特異性、操作步驟和檢測時(shí)間來判斷（李菊等，2020）。在膠體金檢測卡的開發(fā)中， 主要考量的是準(zhǔn)確性和靈敏度，而對于膠體金的廣泛使用，前處理的工藝顯得尤為重要，在操作步驟、提取率和提取時(shí)間上的優(yōu)化，能夠使檢測變得更快捷，更易于基層推廣使用。

根據(jù)GB31650-2019，孔雀石綠為0.5 ng/mL，行業(yè)快檢要求檢測限孔雀石綠為2 ng/mL。 本文對三種同時(shí)檢測隱性孔雀石綠前處理方法進(jìn)行研究和比較， 該三種方法都能達(dá)到同時(shí)檢測隱性孔雀石綠效果。 其中改良氮吹法的最低檢測限能達(dá)到國標(biāo)方法的最低檢測限，反萃取方法和SPE 方法的最低檢測限也都符合國家快檢方法的最低檢測限要求。相比于國標(biāo)方法，該三種方法無論從時(shí)間、成本、操作難度等方面，都具有很大優(yōu)勢，對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的監(jiān)管具有積極意義。

反向萃取法用時(shí)最短， 提取率較其他兩種方法偏低。SPE 方法油脂等雜質(zhì)去除的最干凈，但成本高，操作要求嚴(yán)格。 改良氮吹方法提取率最高，但用時(shí)較長。

本實(shí)驗(yàn)對三種前處理方法與行標(biāo)法進(jìn)行對比，在陰性、 檢出限及2 倍檢出限這三個(gè)濃度點(diǎn)上，四種方法的準(zhǔn)確性均為100%； 半數(shù)檢出限的準(zhǔn)確性存在較大差異， 其中改良氮吹法準(zhǔn)確性最高，假陽性率為10%，行標(biāo)法假陽性率為15%，反萃取法假陽性率為25%，SPE 方法假陽性率最高，為40%。 出現(xiàn)半數(shù)檢出限假陽性的原因可能是氮吹后油脂殘留過多，SPE 過柱時(shí)流速不穩(wěn)定等原因造成的。 但具體的影響因素和影響機(jī)理，如何減弱或盡量避免這些影響因素， 都有待進(jìn)一步研究。

反向萃取法從樣品提取到檢測，用時(shí)最短，總時(shí)間不超過45 min，在限值范圍內(nèi)，準(zhǔn)確率最高，能夠避免使用其他大型儀器， 方便基層的快速使用，使建立第三方快速檢測實(shí)驗(yàn)室成為可能。