氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)飼料中16 種多環(huán)芳烴的方法研究

李德祥， 張艷紅， 張鳳枰*， 鄒昌健

（1.四川威爾檢測(cè)技術(shù)股份有限公司，四川成都610041；2.通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610093；3.通威股份有限公司水產(chǎn)健康養(yǎng)殖四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610093）

多環(huán)芳烴（PAHs）是指分子中含有2 個(gè)或者2 個(gè)以上苯環(huán)的碳?xì)浠衔铮涫怯擅?、石油、木材、有機(jī)高分子化合物等不完全燃燒產(chǎn)生的，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易水解，具有生物累積性、難降解、致癌極強(qiáng)等特點(diǎn) （趙文昌等，2006； 楊發(fā)忠等，2005； 岳敏等，2003）。 美國國家環(huán)境保護(hù)總署（EPA） 把其中16 種PAHs 列入優(yōu)先控制污染物名單（Usepa，1984），2005 年歐盟發(fā)布的《關(guān)于多環(huán)芳香烴的指令》（PAHs 指令2005/69/EC），限制包含苯并芘（Bap）在內(nèi)的16 種PAHs 的使用。 水產(chǎn)飼料為養(yǎng)殖水生動(dòng)物生長(zhǎng)提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)，在大自然環(huán)境中，多環(huán)芳烴通過食物鏈傳遞形式使其原料受到污染， 導(dǎo)致水產(chǎn)飼料中含有多種多環(huán)芳烴， 并通過食物鏈傳遞方式侵入水產(chǎn)品體內(nèi)，最終向人體轉(zhuǎn)移、聚集，危害人類的健康（任憲云，2014； 王 汨，2013；Zhao 等，2013；Roggo 等，2013；豐培娟，2011；Oost 等，2003）。 目前，有關(guān)飼料中多環(huán)芳烴檢測(cè)研究的報(bào)道甚少。 Nácher Mestre Jaime 等（2014）采用氣相色譜-高分辨質(zhì)譜測(cè)定飼料和魚體組織中的多環(huán)芳烴含量； 彭志通等（2016）報(bào)道了氣相色譜質(zhì)譜法快速測(cè)定飼料用油脂中16 種多環(huán)芳烴。 近年來國內(nèi)外多環(huán)芳烴檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速， 多環(huán)芳烴測(cè)定方法主要有液相色譜法（汪晨霞等，2018；Zhu 等，2015）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Kalachova 等，2011）、氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法 （Portolés 等，2017）、氣相色譜-三重四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法（Na′cher-Mestre 等，2009）和氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法（Woudneh 等，2016）等。多環(huán)芳烴的提取方法主要有超聲提取法（劉保獻(xiàn)等，2015）、微波輔助萃取法（王成云等，2018）和加速溶劑萃取法（王道瑋等，2013） 等， 凈化方法主要有固相微萃?。╕ebra-Pimentel 等，2013）和凝膠色譜凈化法（王峰等，2014）。 本文采用超聲提取、全自動(dòng)凝膠色譜技術(shù)對(duì)水產(chǎn)飼料樣品中的多環(huán)芳烴進(jìn)行提取和凈化，以苊-D10、藍(lán)屈-D12和苯并（a）芘-D12為內(nèi)標(biāo)物（GB/T 23213-2008），采用同位素內(nèi)標(biāo)法校正目標(biāo)化合物在前處理過程中的損失，降低基質(zhì)效應(yīng)，旨在建立超聲提取-凝膠色譜凈化-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用定量測(cè)定水產(chǎn)飼料中16 種多環(huán)芳烴含量的方法，為飼料生產(chǎn)企業(yè)多環(huán)芳烴污染控制提供檢測(cè)方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、 試劑和材料 7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；Free style 全自動(dòng)凝膠滲透色譜系統(tǒng) （德國LC Tech 公司）；CP224S 電子天平（德國Sartorius 公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Allegra 64R 冷凍離心機(jī) （美國Beckman Coulter 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI 公司）；氮?dú)鉂饪s儀、WH-3 微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）。

16 種多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL，美國O2si 公司）；苊-D10、藍(lán)屈-D12和苯并（a）芘-D12混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 μg/mL，美國O2si 公司）；正己烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷，均為色譜純；水產(chǎn)飼料樣品，通威股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 苊-D10、 藍(lán)屈-D12和苯并（a）芘-D12混合內(nèi)標(biāo)工作溶液：準(zhǔn)確移取適量苊-D10、藍(lán)屈-D12和苯并（a）芘-D12混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用正己烷配制成2.0 μg/mL 內(nèi)標(biāo)混合工作溶液，搖勻，備用。

多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液： 準(zhǔn)確移取適量16 種多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入適量苊-D10、藍(lán)屈-D12和苯并（a）芘-D12混合內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷稀釋成濃度分別為0、2、5、10、50、100、200 ng/mL 的多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，苊-D10、藍(lán)屈-D12和苯并（a）芘-D12的濃度均為50 ng/mL，搖勻，備用。

1.2.2 樣品前處理 樣品提?。悍Q取5 g（精確到0.01 g） 水產(chǎn)飼料試樣于50 mL 離心管中， 加入100 μL 2 μg/mL 混合內(nèi)標(biāo)工作溶液， 加入20 mL正己烷， 高速漩渦混合1 min， 超聲20 min，8000 r/min 離心5 min， 將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL梨形瓶中；將殘?jiān)?0 mL 正己烷溶液重復(fù)提取兩次，離心后合并上清液于梨形甁中，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約1 mL，氮吹至近干，用乙酸乙酯+環(huán)己烷（1+1）溶液定容至10 mL，漩渦混合溶解，待凈化。

凈化：將凝膠色譜儀調(diào)至最佳工作狀態(tài)，試樣由5 mL 試樣環(huán)注入凝膠滲透色譜（GPC）柱，泵流速5.0 mL/min，用乙酸乙酯+環(huán)己烷（1+1）洗脫，棄去0 ～20 min 流分， 收集20 ～55 min 流分，55 ～60 min 沖洗GPC 柱， 將收集液于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1 mL，氮吹至近干，準(zhǔn)確加入1 mL乙酸乙酯+環(huán)己烷 （1+1）， 漩渦混合1 min，過0.22 μm 微孔濾膜，待GC-MS 測(cè)定。

1.2.3 色譜質(zhì)譜條件 色譜柱：HP-5 MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升溫：初始溫度90 ℃，以20 ℃/min 的速率升溫至180 ℃，以5 ℃/min 的速率升溫至270 ℃， 再以3 ℃/min 的速率升溫至310 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度：310 ℃；離子源溫度：230 ℃；載氣：氦氣，流速1.0 mL/min，純度≥99.999%；電離方式：EI；離子化能量：70 eV；測(cè)定方式：選擇離子監(jiān)測(cè)方式；進(jìn)樣量：1.0 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；溶劑延遲：3 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 飼料樣品提取溶劑的選擇 多環(huán)芳烴為脂溶性化合物，其辛醇水分配系數(shù)（logKow）為3.5 ～6.5，易溶于正己烷、丙酮、二氯甲烷、苯等非極性或中等極性溶劑，現(xiàn)有提取法常采用正己烷、丙酮或二氯甲烷等作為提取劑。本文考察了正己烷、環(huán)己烷、乙腈、乙腈：丙酮（1+1）、正己烷：丙酮（1+1）對(duì)混養(yǎng)魚配合飼料中多環(huán)芳烴的提取效果， 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。 結(jié)果表明，正己烷作為提取溶劑，安全、經(jīng)濟(jì)且平均回收率較高，因此選擇正己烷作為提取溶劑。

表1 不同溶劑對(duì)多環(huán)芳烴的提取效果（回收率）%

2.2 提取方式的選擇 準(zhǔn)確稱取5.0 g 混養(yǎng)魚配合飼料樣品于50 mL 離心管中， 加入等量的內(nèi)標(biāo)、提取溶劑和多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別選擇超聲10、20、30 min 和振蕩30 min，按照上述方法和條件測(cè)定，考察不同提取方式的回收率，結(jié)果見圖1。超聲20 min 和超聲30 min 回收率較高，因超聲20 min 時(shí)間較短，效率較高。故選擇超聲20 min為提取方式。

圖1 不同提取方式對(duì)回收率的影響

2.3 凈化方法的選擇 采用超聲20 min 的提取液， 以不同型號(hào)固相萃取小柱和全自動(dòng)凝膠滲透色譜儀（GPC）進(jìn)行凈化，混養(yǎng)魚配合飼料加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)考察凈化結(jié)果見圖2。 硅膠柱和凝膠滲透色譜（GPC）法的回收率都比較好，但由于水產(chǎn)飼料基質(zhì)非常復(fù)雜， 水產(chǎn)飼料樣品中的和脂溶性色素含量較高，很容易超過硅膠柱的凈化負(fù)荷，總體凈化效果略低于凝膠滲透色譜（GPC）法，故選擇凝膠滲透色譜（GPC）法作為飼料中多環(huán)芳烴測(cè)定的凈化方法。

圖2 凈化方法對(duì)回收率的影響

2.4 色譜質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化 比較了三種程序升溫條件下16 種多環(huán)芳烴的分離效果，升溫程序見表2 ～4，3 種升溫條件均能有效分離目標(biāo)化合物，升溫程序3 在滿足目標(biāo)物分離的前提下，時(shí)間最短，且升溫程序最簡(jiǎn)單，因此選擇升溫條件為升溫程序3， 升溫程序3 目標(biāo)化合物總離子流圖見圖3。 目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和特征離子見表5。

表2 程序升溫條件1

表3 程序升溫條件2

表4 程序升溫條件3

圖3 16 種多環(huán)芳烴和同位素內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖

2.5 線性范圍、檢出限和定量限 配制2、5、10、50、100、500、1000 ng/mL 的多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在上述色譜質(zhì)譜條件下分析測(cè)定。以各多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)（x），相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，以3 倍信噪比估算儀器檢出限（LOD），10倍信噪比計(jì)算定量限（LOQ），結(jié)果見表6。

表5 16 種多環(huán)芳烴的參考保留時(shí)間及特征離子

表6 16 種多環(huán)芳烴回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限及定量限

表7 不同飼料樣品的加標(biāo)回收率 %

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度考察 本方法考察了16 種多環(huán)芳烴在草魚育成配合飼料、 小龍蝦膨化配合飼料、南美白對(duì)蝦配合飼料和石斑魚膨化配合飼料中的添加回收實(shí)驗(yàn)。 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在樣品中添加2.0、5.0、20.0 μg/kg 3 個(gè)濃度梯度的16 種多環(huán)芳烴進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，每次各濃度完成4 個(gè)樣品3 平行試驗(yàn)，并重復(fù)3 次，計(jì)算回收率和批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算結(jié)果見表7。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定 采用本方法對(duì)草魚育成配合飼料、小龍蝦膨化配合飼料、南美白對(duì)蝦配合飼料和石斑魚膨化配合飼料等實(shí)際樣品中16 種多環(huán)芳烴進(jìn)行測(cè)定，所有樣品均有檢出，檢測(cè)結(jié)果見表8。

3 結(jié)論

本文采用正己烷超聲提取、 全自動(dòng)凝膠色譜儀（GPC）凈化、GC-MS 同位素內(nèi)標(biāo)法定量，建立一種水產(chǎn)飼料中16 種多環(huán)芳烴殘留量的定性定量測(cè)定方法，在2.0、5.0、20.0 μg/kg 添加水平下平均回收率分別為81.5% ～99.3%、80.2% ～97.4%、83.1% ～99.8%，所建立的方法定量準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，具有較強(qiáng)的復(fù)雜基質(zhì)抗干擾能力，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足日常批次水產(chǎn)飼料樣品分析檢測(cè)要求， 為水產(chǎn)飼料質(zhì)量安全控制提供了可靠的檢測(cè)方法依據(jù)。

表8 飼料實(shí)際品測(cè)定結(jié)果 μg/kg