口腔白斑病中黏著斑激酶對細(xì)胞增殖的影響

律 娜 肖 宇 孫 明

口腔白斑病(oral leukoplakia, OLK)屬于癌前病變，能癌變成惡性腫瘤。目前，關(guān)于OLK癌變的分子過程尚未清楚，因此，探尋其癌變成口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)的相關(guān)分子標(biāo)記物，阻斷其癌變進(jìn)程是當(dāng)前研究的重點。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖與OLK的預(yù)后與轉(zhuǎn)歸有一定的聯(lián)系。黏著斑激酶(focal adhension kinase, FAK)是一類多功能的非受體型酪氨酸激酶，通過酪氨酸激酶受體等數(shù)條信號傳輸通路介入細(xì)胞的多種生物學(xué)進(jìn)程。FAK與腫瘤干細(xì)胞的存活、遷移、入侵以及增殖等生物學(xué)行為有關(guān)，由于腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是癌癥的來源，因此，F(xiàn)AK具備潛在的癌基因特點，與某些惡性腫瘤的發(fā)展和預(yù)后息息相關(guān)。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是一種核蛋白，是評估細(xì)胞增殖活性的優(yōu)良標(biāo)志。在許多腫瘤中，PCNA與腫瘤的預(yù)后和生存息息相關(guān)，如結(jié)腸癌、乳腺癌。為此，本研究對41例進(jìn)行OLK手術(shù)切除患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，應(yīng)用免疫組織化學(xué)同逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù)檢測FAK與PCNA在OLK及健康口腔黏膜的表達(dá)水平，探討FAK對細(xì)胞增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月至2019年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行OLK手術(shù)切除的41例患者。41例患者的OLK標(biāo)本作為試驗組，其中，男性24例，女性17例；年齡18～65歲，中位年齡為47.60(41.50，57.25)歲；采取雙盲法按照組織病理學(xué)診斷的準(zhǔn)則，將試驗組41例OLK標(biāo)本分為OLK上皮單純增生組(

n

=10)、OLK上皮輕度異常增生組(

n

=11)、OLK上皮中度異常增生組(

n

=13)和OLK上皮重度異常增生組(

n

=7)。另同期選取10例進(jìn)行囊腫切除術(shù)以及智齒拔除術(shù)患者的正?？谇火つそM織作為對照組(

n

=10)。其中，男性6例，女性4例；年齡18～65歲，中位年齡為53.39(51.00，60.00)歲。試驗組與對照組的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見表1。所有接受本次試驗的患者及家屬均知情同意，并簽署知情同意書，本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員審核，批準(zhǔn)后實施。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整者；②病理診斷，實驗室相關(guān)檢查確診為OLK者；③未檢查出其他類型的口腔黏膜疾病者；④就診前2個月內(nèi)未使用藥物治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往接受過放化療治療者；②使用過激素類藥物者；③有系統(tǒng)性疾病以及感染性疾病者；④臨床資料不完整者。

1.3 實驗試劑 小鼠抗人FAK單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；小鼠抗人PCNA單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化染色超敏試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；ReverTra Ace CDNA合成試劑盒[東洋紡(上海)生物科技有限公司]； SYBR Safe TM DNA gel stain(美國Invitrogen公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 標(biāo)本的處理 根據(jù)標(biāo)本的大小，一些置于10%福爾馬林固定，常規(guī)病理檢查。其余部分立刻浸入RNA later溶劑，在4℃冷藏箱中放置過夜，而后再移入到-80℃冷藏箱中。41份OLK標(biāo)本由2名病理科醫(yī)師確診。

1.4.2 超敏S-P法染色 石蠟切片脫蠟水化，檸檬酸組織抗原修復(fù)液微波修復(fù)抗原，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加山羊血清37℃孵育10 min，分別增添一抗FAK(1∶100)與PCNA(1∶100)4℃培養(yǎng)過夜，增添生物素標(biāo)記二抗，37℃培養(yǎng)10 min，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶溶液孵育后，3,3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色，鏡下控制反應(yīng)時間3～5 min，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對照，已知陽性片作為陽性對照。

1.4.3 RT-PCR實驗方法 TRIZOL法提取總RNA，引物由上海生物工程有限公司合成。FAK擴(kuò)增產(chǎn)物長度為210 bp，上游引物：5’-ATGTTCTGGTGTCCTCAAATG-3’，下游引物：5’-GAGGTAAAACGTCGAAAATTG-3’。內(nèi)參引物β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物長度為465 bp，上游引物：5’-CGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3’，下游引物：5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min進(jìn)入循環(huán)，94℃變性40 s，退火1 min(各目的基因的退火溫度分別為：FAK 59.2℃、β-actin 56.1℃)，72℃延伸1.5 min，經(jīng)32個循環(huán)擴(kuò)增后72℃延伸10 min。

1.5 結(jié)果判定和圖像分析 FAK陽性細(xì)胞胞漿呈淡黃至棕黃色。隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，使用Axio Vision成像系統(tǒng)拍照，ImagePro-Plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)進(jìn)行圖像分析。按照程序使用書，首先，將圖像實施光密度修改(灰度域0～230)，之后采取3個參數(shù)對結(jié)果解析：①陽性染色百分比(percentage of immunostained area，ImA)= 胞漿陽性細(xì)胞染色面積/(胞漿陽性染色面積+胞漿陰性染色面積)×100%；②陽性染色平均光密度值(mean intensity of immunostained area，ImIn)=積分光密度值(integrated optical density，IOD)/胞漿陽性染色面積；③免疫組化指數(shù)(inedx of total immunopositivity，ImT)=ImA×ImIn=IOD/(胞漿陽性染色面積+胞漿陰性染色面積)。

細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferative index，PI)分析：PCNA陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞核，高倍鏡下陽性著色顆粒感明顯。PI的計算：每張切片在病變典型處連續(xù)計數(shù)5個高倍視野(×400)，計數(shù)1 000個細(xì)胞中增殖細(xì)胞所占的百分比。

電泳及半定量研究：標(biāo)本依次實現(xiàn)目的基因及對照基因的擴(kuò)增后，各個加樣孔內(nèi)都增加同一標(biāo)本的FAK產(chǎn)物8 μL及β-actin產(chǎn)物4 μL，2%瓊脂糖凝膠、70 V恒壓電泳60 min，采用AlphaImageTM 2200數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照后，采取Axio Vision成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，得到目的條帶的IOD。雙蒸水代替引物當(dāng)作空白對照，不加模板或引物或Taq酶分別做陰性對照。各標(biāo)本的RT-PCR半定量比值(ratio, R)=目的條帶的IOD /相應(yīng)內(nèi)參的IOD。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 FAK免疫組化的陽性染色為淺黃至棕黃色，表達(dá)于胞質(zhì)。正常黏膜上皮基底細(xì)胞層的胞質(zhì)呈淺黃色弱陽性表達(dá)，固有細(xì)胞層也有為數(shù)不多弱陽性表達(dá)；由于上皮異常增生程度加劇，F(xiàn)AK陽性表達(dá)遍及基底細(xì)胞層與棘細(xì)胞層，同時固有細(xì)胞層其表達(dá)逐漸呈強(qiáng)陽性，F(xiàn)AK陽性染色強(qiáng)度由淡黃色至棕黃色。見圖1。

圖1 FAK在口腔黏膜組織中的表達(dá)(SP×400)

PCNA陽性染色為棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞核。正常黏膜內(nèi)陽性表達(dá)分布于上皮基底層，數(shù)目不多。但是由于黏膜上皮異常增生的水平加劇，其表達(dá)數(shù)量顯著增長，自基底細(xì)胞層至棘細(xì)胞層及表層均有表達(dá)。見圖2。

圖2 PCNA在口腔黏膜組織中的表達(dá) (SP×400)

2.2 5組FAK蛋白表達(dá)量比較 5組FAK蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，對照組與OLK上皮單純增生組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)；OLK上皮輕度異常增生組的FAK蛋白表達(dá)量高于OLK上皮單純增生組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；OLK上皮中度異常增生組的FAK蛋白表達(dá)量高于OLK上皮輕度異常增生組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；OLK上皮重度異常增生組的FAK蛋白表達(dá)量高于OLK上皮中度異常增生組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見表2。2.3 5組PI指數(shù)比較 5組PI指數(shù)進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，對照組與OLK上皮單純增生組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)；OLK上皮輕度異常增生組的PI指數(shù)高于OLK上皮單純增生組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；OLK上皮中度異常增生組的PI指數(shù)高于OLK上皮輕度異常增生組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；OLK上皮重度異常增生組的PI指數(shù)高于OLK上皮中度異常增生組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見表2。

表2 5組FAK蛋白、FAK mRNA和PI表達(dá)量比較

2.4 FAK半定量比值比較 所有標(biāo)本均擴(kuò)增出210 bp FAK產(chǎn)物及465 bp β-actin產(chǎn)物，見圖3。5組FAKmRNA相對表達(dá)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=0.331，

P

=0.856)。見表2。

圖3 FAK mRNA 在OLK組織中的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 FAK表達(dá)與細(xì)胞增殖的相關(guān)性分析 隨著OLK上皮異常增生水平程度的加劇，F(xiàn)AK表達(dá)水平與PI指數(shù)呈線性正相關(guān)(

r

=0.964，

P

<0.001)。見圖4。

圖4 FAK免疫組化指數(shù)與PI的相關(guān)性

3 討論

目前，研究表明在許多上皮來源或間充質(zhì)的惡性腫瘤中FAK蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，例如在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等。FAK的表達(dá)水平改變可能是惡性腫瘤發(fā)展過程中特征之一。同時研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中PCNA的高表達(dá)與OSCC的組織學(xué)分級呈正相關(guān)，PCNA表達(dá)水平越高提示腫瘤分化程度越低。研究表明，OLK的癌變率為0.13%～17.5%。其病理表現(xiàn)為上皮單純增生或不典型增生，即輕度、中度和重度異常增生，并且最終可能發(fā)展為OSCC。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在癌前病變OLK中FAK和PCNA的表達(dá)水平同正常黏膜組織之間存在差異，F(xiàn)AK和PCNA在OLK上皮異常增生患者中維持高水平表達(dá),可能與OLK癌變進(jìn)展過程相關(guān)，促進(jìn)OLK向OSCC發(fā)展，這對研究如何阻斷OLK癌變過程實現(xiàn)早期防治具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，在OLK上皮單純增生的患者中，F(xiàn)AK和PCNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)，而在OLK上皮異常增生的患者中，F(xiàn)AK和PCNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。并且在不同程度的OLK上皮異常增生患者之間，F(xiàn)AK和PCNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。提示在OLK向OSCC發(fā)展的過程中，F(xiàn)AK和PCNA的過表達(dá)出現(xiàn)于OLK早期癌變中，且隨著黏膜上皮異常增生水平的加劇，F(xiàn)AK和PCNA的表達(dá)水平與OLK上皮異常增生水平密切相關(guān)，可能與OLK癌變進(jìn)展過程相關(guān)。并且PCNA的表達(dá)在正常黏膜組織與OLK上皮異常增生組織之間存在差異，與Poosarla 等研究結(jié)果相一致。同時Kurio等研究表明FAK過表達(dá)于OSCC中，并且能夠影響OSCC的進(jìn)展，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在OLK癌變早期，F(xiàn)AK的表達(dá)水平就顯著上調(diào)，猜測在OLK癌變的早期FAK已經(jīng)維持高水平的表達(dá)，這一現(xiàn)象對OLK向OSCC的進(jìn)展具有積極作用。此外，本研究還采用RT-PCR方法檢測OLK組織中FAK mRNA水平，結(jié)果顯示各病理分組中均有FAK mRNA表達(dá)，但統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)各分組當(dāng)中FAK mRNA表達(dá)無明顯差異(

P

>0.05)。表明FAK在轉(zhuǎn)錄水平上未發(fā)生明顯改變，而在蛋白水平卻具有差異，可能存在FAK轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制。本研究還發(fā)現(xiàn)FAK的表達(dá)和PCNA二者之間具有一定關(guān)系。由健康的黏膜向OLK輕度異常增生至重度異常增生轉(zhuǎn)變的過程中，F(xiàn)AK與PCNA表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系(

r

=0.964，

P

<0.05)，推測是這二者之間的協(xié)同作用最終導(dǎo)致了OSCC的發(fā)生。

綜上所述，通過對OLK患者中FAK和PCNA表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)FAK與PCNA在OLK上皮異常增生的患者中表達(dá)上調(diào)，二者的表達(dá)水平與OLK的癌變過程有關(guān)，可能作為評價OLK癌變過程的潛在標(biāo)記物，這對研究OLK癌變過程中的相關(guān)分子標(biāo)記物以及如何阻斷OLK向OSCC發(fā)展等方面具有一定價值。在今后的研究中，將進(jìn)一步探討FAK轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制，為阻斷OLK癌變的過程提供一些新的研究思路或方向。