鐵死亡在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的研究進展

朱凱驛 綜述 黑明燕 審校

（首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院新生兒中心/國家兒童醫(yī)學中心，北京 100045）

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic‐ischemic brain damage, HIBD）是由于圍生期窒息導致的新生兒腦部缺氧缺血性損害，是導致新生兒致殘甚至死亡的主要原因，目前臨床上針對HIBD無特異的治療手段[1‐2]。臨床研究資料顯示，盡管及時采取亞低溫療法，仍有部分圍生期重度窒息新生兒發(fā)生不良結局，包括死亡、腦性癱瘓、智力障礙、癲癇等永久性神經損傷后遺癥，給患兒家庭及社會帶來巨大的經濟負擔[2‐3]。導致HIBD的機制很復雜，包括能量消耗、線粒體損傷、興奮性氨基酸及活性氧（reactive oxygen species, ROS）的產生和炎癥反應等，所有這些機制都會導致不同類型的細胞死亡[2‐4]。

鐵死亡（ferroptosis）是近年來發(fā)現的一種新型細胞死亡方式，與許多疾病的病理生理過程密切相關[4‐5]。2003年在一項大規(guī)模篩選各種化合物對腫瘤細胞殺傷作用的研究中，首次發(fā)現愛拉斯汀（erastin）可導致腫瘤細胞出現這種不同于傳統(tǒng)細胞凋亡的新型死亡方式[6]；2008年Yang等[7]發(fā)現化合物Ras選擇性致死化合物（Ras‐selective lethal compounds, RSL）3和RSL5，與erastin具有相同的作用，并且鐵螯合劑去鐵胺B‐甲磺酸鹽和抗氧化劑維生素E可以抑制這種細胞死亡；2012年首次出現用“ferroptosis”描述這種有鐵離子依賴性、氧化型的全新細胞死亡模式，即鐵死亡[8]。鐵死亡在細胞形態(tài)上明顯不同于凋亡、自噬和壞死性凋亡等其他細胞死亡方式，例如，鐵死亡沒有細胞凋亡的特征：如細胞萎縮、染色質濃縮、凋亡小體形成和核碎裂；沒有細胞自噬的特征：如雙膜自噬溶酶體形成；也不具有典型細胞壞死性凋亡的形態(tài)特征，如細胞質和細胞器腫脹及細胞膜破裂等[5,9]。

鐵死亡的形態(tài)和生化特點表現為細胞內鐵離子過度沉積、膜脂質過氧化水平升高，線粒體皺縮、嵴減少及膜密度增厚等特點[10‐11]。鐵死亡在發(fā)病機制中也與其他細胞死亡方式明顯不同，例如，凋亡主要通過細胞凋亡的膜受體途徑和內質網細胞途徑，導致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶激活，從而導致凋亡發(fā)生；自噬主要通過激活MAPK和mTOR信號通路發(fā)生；壞死性凋亡主要通過腫瘤壞死因子或Toll樣受體3介導的信號通路，導致受體相互作用蛋白1、受體相互作用蛋白3和混合系列蛋白激酶樣結構域激活引起[5,9,12]。而鐵死亡是一種鐵離子依賴性的新型程序性細胞死亡方式，主要由于鐵代謝異常、脂質代謝異常、谷胱甘肽與谷胱甘肽過氧化物酶‐4調控異常等引起[5]。而且，鐵死亡不能被凋亡、自噬或壞死性凋亡等其他細胞死亡方式的特異性抑制劑抑制[13]。

越來越多的證據表明鐵死亡與多種疾病的細胞損傷相關，如腫瘤、缺血再灌注損傷、腦卒中、神經退行性病變、心肌梗死、急性腎損傷、肝損傷等[11,14‐18]，但鐵死亡在HIBD發(fā)病機制中的作用及途徑尚不明確，是目前HIBD發(fā)病機制研究的新熱點。目前已知鐵代謝異常、谷氨酸反向轉運體功能異常和脂質過氧化物調控異常是導致鐵死亡的主要原因[13‐14,19]，而這些代謝異常也在HIBD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[3‐4]，因此本文主要圍繞與鐵死亡及HIBD均密切相關的鐵代謝異常、胱氨酸/谷氨酸反向轉運體功能異常和脂質過氧化物調控異常的研究進展進行綜述。

1 鐵代謝異常與鐵死亡

鐵是細胞鐵死亡的必要組成部分[15]。細胞中的鐵以兩種形式存在：二價鐵離子（Fe2+）和三價鐵離子（Fe3+），含Fe2+的蛋白質一直作為輔助因子和催化劑參與各種氧化還原反應，而Fe3+是鐵主要的儲存和運輸形式。循環(huán)中的Fe3+通過細胞膜轉鐵蛋白受體1進入細胞內，細胞內Fe3+通過鐵還原酶被還原為Fe2+，而Fe2+通過細胞膜鐵轉運蛋白氧化成Fe3+，并將細胞內Fe2+釋放到不穩(wěn)定的鐵池中[13,20‐21]。另外鐵及其衍生物對線粒體電子傳遞鏈中產生ROS的酶和亞單位的功能至關重要，因為過量的鐵原子可以向O2和H2O2提供電子，產生超氧陰離子和羥自由基，這兩種自由基都可以通過氧化蛋白質、脂質和核酸來破壞細胞；并且過多的外源鐵能夠通過Fenton反應生成ROS導致鐵死亡的發(fā)生[13,21]，也可作為含鐵酶的輔助因子發(fā)揮作用，導致谷胱甘肽耗盡從而導致鐵死亡發(fā)生[13,22]。Erastin誘導的鐵死亡中可以檢測到外源鐵增加和ROS積累，而這一過程可以被鐵的鰲合劑抑制[4]。研究表明通過沉默鐵代謝主要轉錄因子鐵反應元件結合蛋白2基因，使細胞內鐵含量降低，可以抑制erastin誘導的鐵死亡[8]。此外，鐵還是構成脂質過氧化作用中氧化酶亞基的重要成分。脂氧合酶可以通過細胞膜的過氧化作用來促進鐵死亡發(fā)生，鐵螯合劑（去鐵胺和去鐵酮）可以通過去除脂氧合酶催化過程中必須的鐵來抑制鐵死亡發(fā)生[20,23]。因此鐵參與脂質過氧化物積累和鐵死亡發(fā)生過程，鐵的輸入、排出、儲存和流通量都對細胞鐵死亡有重要的影響[24]。

2 胱氨酸/谷氨酸反向轉運體與鐵死亡

細胞膜胱氨酸/谷氨酸反向轉運體是一種異二聚胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白，包括功能亞基溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7，member 11，SLC7A11）和調節(jié)亞基溶質載體家族3成員2，它通過將谷氨酸轉運至細胞外從而將胱氨酸攝入細胞內，進一步還原為半胱氨酸，合成細胞內主要的抗氧化劑谷胱甘肽，從而維持細胞內外氧化還原平衡[4,13,20]。谷胱甘肽作為最豐富的抗氧化劑，其功能是保護細胞免受ROS的損傷[25]。此外谷胱甘肽作為谷胱甘肽過氧化物酶4的輔助因子，對于抑制鐵死亡是必需的[8,13]。在合成谷胱甘肽所需的3個氨基酸中，其中半胱氨酸通常含量最少，因此半胱氨酸被認為是限制谷胱甘肽合成速率的關鍵氨基酸[26]。半胱氨酸可以通過轉硫途徑由蛋氨酸在某些細胞中合成，但是在其他許多細胞中，半胱氨酸的導入對于維持半胱氨酸和谷胱甘肽的水平并防止鐵死亡至關重要[3,26]。相反，由細胞膜胱氨酸/谷氨酸反向轉運體抑制引起的谷胱甘肽耗竭與多種人類疾病有關，尤其是中樞神經系統(tǒng)疾病[8]。細胞膜胱氨酸/谷氨酸反向轉運體依賴的抗氧化防御系統(tǒng)在受到一些化合物如erastin、谷氨酸、磺胺嘧啶和索拉非尼等抑制時，會通過消耗半胱氨酸，導致谷胱甘肽合成降低、谷胱甘肽過氧化物酶4失活、脂質代謝積累，最終導致細胞氧化損傷和細胞鐵死亡的發(fā)生[4,27‐28]。而SLC7A11作為細胞膜胱氨酸/谷氨酸反向轉運體的重要組成部分，沉默SLC7A11基因會使細胞對erastin誘導的鐵壞死更加敏感[29]。因此胱氨酸/谷氨酸反向轉運體，包括谷氨酸和谷氨酰胺等轉運和生產的物質，都是鐵死亡的關鍵調節(jié)因子[30]。

3 脂質過氧化物調控異常與鐵死亡

盡管鐵死亡是最近發(fā)現的一種依賴于 ROS的程序性細胞死亡形式，但其分子機制和生化功能仍知之甚少。其中脂質在能量供應和細胞內膜系統(tǒng)的組成中起關鍵作用，如磷脂（例如磷脂酰膽堿、心磷脂）的氧合作用促進細胞鐵死亡發(fā)生[31‐32]。脂質過氧化物主要通過細胞中的3個途徑產生，所有這些途徑都需要鐵：（1）鐵通過Fenton反應以非酶的方式產生的脂質ROS；（2）通過多不飽和脂肪酸的氧化和酯化反應生成的脂質過氧化物；（3）由鐵催化方式的脂質自氧化[13]。

目前，人們認為ROS導致鐵死亡的重要原因之一是脂膜的多不飽和脂肪酸在ROS的積累下轉化為脂質過氧化物[33]。ROS的積累是由Fenton反應、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依賴性脂質過氧化和谷胱甘肽缺失引起的[34]。過量的ROS產生可能引起細胞氧化應激，并破壞DNA、蛋白質及脂質[35]。谷胱甘肽過氧化物酶4的失活會導致脂質過氧化物的積累，這是導致細胞鐵死亡的關鍵信號[13]。在生理條件下，谷胱甘肽過氧化物酶4能將谷胱甘肽作為輔因子將脂質過氧化物還原為脂質醇，催化循環(huán)消耗2個谷胱甘肽分子，最終迅速去除多余的脂質過氧化物，防止鐵死亡的發(fā)生；但是，當氧化損傷產生大量的脂質過氧化物或過量鐵積累，導致谷胱甘肽消耗殆盡，進而促使谷胱甘肽依賴的谷胱甘肽過氧化物酶4活性下降，最終便會發(fā)生鐵死亡現象[33,36]。在Fe2+積累的情況下，脂質氫過氧化物可以被Fe2+還原，生成高反應性烷氧基，這些自由基可以通過脂質過氧化反應直接破壞相鄰的多不飽和脂肪酸，引起大量與脂類相關的ROS積累，導致細胞內鐵死亡的發(fā)生[37]。通過熒光探針二氯熒光素、2', 7'‐二氯二氫熒光素二乙酸酯和脂質過氧化熒光探針等技術已經證明erastin誘導的鐵死亡中存在脂質ROS的積累；RSL3誘導的鐵死亡中通過結合或抑制谷胱甘肽過氧化物酶4，從而增加脂質ROS積累，導致脂質過氧化作用增強，進一步證明了ROS在鐵死亡中的作用[4,38]。

因此脂質過氧化在鐵死亡中起主要作用，相反，抗氧化調節(jié)劑如谷胱甘肽過氧化物酶 4、細胞膜胱氨酸/谷氨酸反向轉運體等可以在不同水平上發(fā)揮作用，以限制鐵死亡的氧化損傷[36]。并且研究發(fā)現了多種親脂性抗氧化劑如生育酚、丁基化羥基甲苯、β‐胡蘿卜素、ferrostatin‐1和liproxstatin‐1等可作為erastin誘導細胞鐵死亡的強抑制物[4]。鑒于鐵死亡與氧化應激的相關性，氧化損傷和谷氨酸興奮毒性所致細胞死亡的機制也是導致鐵死亡的原因。

4 鐵死亡與HIBD

HIBD是新生兒死亡和長期殘疾的最常見原因之一，發(fā)病率為2‰~3‰[1]。HIBD后神經細胞死亡是導致長期神經系統(tǒng)損傷的主要原因[39]。圍生期HIBD誘導的細胞死亡在24~48 h達到峰值，但此病理過程可以持續(xù)數周，并且這種長時間細胞損傷最終導致大腦容量明顯減少[4]。凋亡和壞死是腦細胞死亡的兩個主要機制，但是越來越多的研究表明，其他不同細胞死亡形式同時發(fā)生或相繼發(fā)生[40]。此外，當上游損害因素高于保護性反應的情況下，如果抑制了一種細胞死亡模式，則另一種死亡途徑可能會介入[40]。已有研究證明凋亡、壞死、自噬和焦亡等幾種類型的細胞死亡方式都與新生兒腦損傷關系密切[4,41‐42]。在發(fā)現鐵死亡后，最近的研究也證明鐵死亡和腦神經系統(tǒng)疾病之間關系密切[16,38]。因此了解鐵死亡在導致HIBD細胞死亡中的潛在分子機制，可為預防和治療新生兒缺氧缺血性腦病提供新策略和新方法。

鐵死亡在成年動物腦損傷中明確存在，不同的鐵螯合劑及其類似物在預防這些疾病方面顯示出巨大的潛力。實驗研究表明對小鼠行大腦中動脈阻塞術后發(fā)現，腦組織中鐵沉積增加，給予注射鐵死亡特異性抑制劑liproxstatin‐1后可以減輕腦梗死面積并且改善腦損傷小鼠認知功能；而給予鐵死亡特異性抑制劑ferrostatin‐1后，也能顯著改善神經功能損傷，由此說明鐵死亡加重了腦缺血再灌注損傷[15]。另外，在新生鼠HIBD模型中，也可以觀察到神經元發(fā)生鐵死亡，并且給予注射鐵死亡抑制劑褪黑素后，能明顯抑制神經元鐵死亡，促進海馬神經元存活，提高HIBD大鼠的學習和記憶能力；使用谷胱甘肽抑制劑RSL3后，可以抑制過氧化物4，促進鐵死亡，消除褪黑素對HIBD的保護作用[38]。因此，鐵死亡在HIBD中可能起重要作用。

在HIBD時，由于細胞內pH低，蛋白質結合的鐵從其結合蛋白中釋放出來，并快速在新生大鼠受損神經元和腦室周圍白質積累；在新生鼠模型中鐵超載導致腦組織氧化應激及腦室周圍囊性白質病變[4]。在新生大鼠HIBD模型中，鼻內注射載脂蛋白（轉鐵蛋白的脂溶性形式），可以減輕腦白質損傷和神經元丟失，并且抑制星形膠質細胞增生，提示超負荷游離鐵可以保護細胞免受HIBD氧化應激導致的損傷[43]。促紅細胞生成素可通過多種機制起到神經保護作用，包括神經營養(yǎng)、抗氧化、抗凋亡等等，研究表明接受促紅細胞生成素治療的早產兒可以通過降低血清脂質過氧化而降低血清鐵蛋白，因此促紅細胞生成素也可能通過降低未結合鐵和脂質過氧化物水平而抑制鐵死亡的發(fā)生，從而起到神經保護作用[4,44]。

過多的谷氨酸是引發(fā)鐵死亡的主要因素之一。新生兒缺血缺氧時導致神經元和神經膠質細胞去極化，隨后將興奮性氨基酸（如谷氨酸）釋放到細胞外，導致基底節(jié)區(qū)、丘腦及側腦室等部位谷氨酸升高，并且在缺血缺氧損傷嚴重的嬰兒腦脊液中可以檢測出谷氨酸的升高[45]。此外，鐵死亡是谷氨酸誘導的神經元細胞死亡的組成部分[46]。氧化作用中谷氨酸介導的細胞膜胱氨酸/谷氨酸反向轉運體抑制是誘導鐵死亡的主要原因，研究表明缺氧時新生兒腦室周圍白質中谷胱甘肽減少，永生的海馬神經元HT22細胞株在缺氧時也發(fā)現由谷氨酸毒性介導的細胞膜胱氨酸/谷氨酸反向轉運體抑制和谷胱甘肽消耗[4]。天麻在治療神經相關疾病中具有很強的抗氧化活性，研究證明，用天麻預處理HT22細胞可顯著抑制谷氨酸誘導的細胞鐵死亡的發(fā)生[46]。原代小膠質細胞在缺氧條件下，脂質過氧化作用增強，谷胱甘肽水平降低，而鐵螯合劑去鐵胺可以減少鐵誘導的ROS及促炎細胞因子產生[6]。

足月嬰兒的大腦富含多不飽和脂肪酸，但抗氧化劑含量低，因此特別容易受到自由基的攻擊[47]。新生兒HIBD 12~48 h內時，氧自由基產生增加，并與細胞膜中的不飽和脂肪酸反應，然后導致神經毒性脂質過氧化物產生[47‐48]。在圍生期窒息新生兒的臍帶血中脂質過氧化的最終產物丙二醛增高，并與HIBD損傷程度相關[49]。大量證據已經證明，抗氧化可以減少神經相關疾病中鐵死亡的發(fā)生。例如天麻預處理抑制了谷氨酸誘導的HT22細胞中ROS的積累，增加超氧化物歧化酶活性，減少丙二醛含量，最終抑制神經元細胞鐵死亡的發(fā)生[46]；鐵死亡特異性抑制劑ferrostatin‐1可以通過降低脂質ROS的產生及環(huán)氧合酶2的表達，從而抑制神經元鐵死亡的發(fā)生[50]；抗氧化劑香芹酚通過降低缺血性腦組織中脂質過氧化物的水平，抑制海馬神經元鐵死亡的發(fā)生，從而改善腦缺血導致的學習和記憶能力損傷[51]。

雖然發(fā)育中大腦的細胞死亡機制與成人相比不完全相同，也沒有明確的臨床體內研究證明HIBD時鐵死亡的發(fā)生，但是鐵代謝、氨基酸代謝和脂質過氧化物調控異常等鐵死亡相關機制在HIBD中起重要作用，因此鐵死亡可能在HIBD中也起重要作用。

5 結語及展望

鐵死亡作為一種新型的可調控的細胞死亡方式，通過影響鐵代謝、胱氨酸/谷氨酸反向轉運體和脂質過氧化物等方面在HIBD的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，因此其具有成為治療HIBD新靶點的潛力（圖1）。但我們對鐵死亡的了解仍處于早期階段，由于鐵死亡的復雜性，導致對鐵死亡在HIBD中發(fā)揮的具體機制及作用仍不完全清楚。因此，期望隨著人們對鐵死亡及HIBD之間的因果關系和作用機制的深入研究，臨床上可能涌現出通過干預鐵死亡而診治HIBD的新途徑和新方法，以減輕HIBD患兒家庭和社會所承受的沉重負擔。

圖1 鐵死亡在HIBD中的作用機制假設示意圖